Abi1 Antibody [D2H9] Datasheet

生物描述

特异性	Abi1 Antibody [D2H9] 可检测内源性 Abi1 总蛋白水平。
背景	Abelson 相互作用蛋白 1 (Abi1, ABI1) 是 Abi 家族的衔接蛋白，其功能位于受体或生长因子激活的酪氨酸激酶（包括 c-Abl）的下游，并将输入信号整合到肌动蛋白依赖性细胞骨架重塑和生长因子信号传导中。Abi1 包含多个模块化结构域，这些结构域支持其支架功能：一个 WAVE 结合区，可募集 WAVE 复合物亚基（例如 WAVE2）；SH3 结构域，可与 c-Abl 上的富含脯氨酸的基序结合；以及一个 PXXP 序列和一个 PEST 样区域，该区域可被磷酸化，从而为含有 SH2 结构域的信号蛋白提供对接位点。 Abi1作为WAVE调控复合物的核心元件，促进Rac驱动的肌动蛋白聚合和片状伪足的形成。它还参与与SOS1和EPS8形成的替代复合物，这些复合物将Ras激活与Rac和肌动蛋白重塑联系起来，从而协调定向迁移和侵袭伪足的形成。在生长因子和激酶信号传导的背景下，c-Abl在Y213位点磷酸化Abi1，生成一个磷酸酪氨酸基序，该基序可独立募集c-Abl和PI3K的p85调节亚基的SH2结构域，从而将Abi介导的细胞骨架动力学与PI3K-Akt激活和其他PI3K依赖性信号通路偶联起来。 Abi1 在 Y435 位点的磷酸化增强了肿瘤细胞粘附、细胞外基质降解和侵袭行为，这种修饰受到 c-Abl 的严格调控，使 Abi1 成为连接 Abl 激酶活性与结直肠癌和其他癌中肌动蛋白驱动的侵袭和基质重塑的机制节点。

特异性

Abi1 Antibody [D2H9] 可检测内源性 Abi1 总蛋白水平。

背景

Abelson 相互作用蛋白 1 (Abi1, ABI1) 是 Abi 家族的衔接蛋白，其功能位于受体或生长因子激活的酪氨酸激酶（包括 c-Abl）的下游，并将输入信号整合到肌动蛋白依赖性细胞骨架重塑和生长因子信号传导中。Abi1 包含多个模块化结构域，这些结构域支持其支架功能：一个 WAVE 结合区，可募集 WAVE 复合物亚基（例如 WAVE2）；SH3 结构域，可与 c-Abl 上的富含脯氨酸的基序结合；以及一个 PXXP 序列和一个 PEST 样区域，该区域可被磷酸化，从而为含有 SH2 结构域的信号蛋白提供对接位点。 Abi1作为WAVE调控复合物的核心元件，促进Rac驱动的肌动蛋白聚合和片状伪足的形成。它还参与与SOS1和EPS8形成的替代复合物，这些复合物将Ras激活与Rac和肌动蛋白重塑联系起来，从而协调定向迁移和侵袭伪足的形成。在生长因子和激酶信号传导的背景下，c-Abl在Y213位点磷酸化Abi1，生成一个磷酸酪氨酸基序，该基序可独立募集c-Abl和PI3K的p85调节亚基的SH2结构域，从而将Abi介导的细胞骨架动力学与PI3K-Akt激活和其他PI3K依赖性信号通路偶联起来。 Abi1 在 Y435 位点的磷酸化增强了肿瘤细胞粘附、细胞外基质降解和侵袭行为，这种修饰受到 c-Abl 的严格调控，使 Abi1 成为连接 Abl 激酶活性与结直肠癌和其他癌中肌动蛋白驱动的侵袭和基质重塑的机制节点。

使用信息

抗体应用

WB, IP

稀释比例

WB	IP
1:1000	1:100

反应性

Human, Mouse, Rat

抗体类型

Rabbit Monoclonal Antibody

MW

55-65 kDa

储存液配方

PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3

储存条件
(自收到货起)

-20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years

实验方法
WB	实验步骤：样品制备 1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液； 5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度； 6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。电泳分离 1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）转膜 1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中； 2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗； 3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表湿转法参考条件：200 mA, 120 min。（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）封闭 1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min； 2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温； 3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。抗体孵育 1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min； 3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h； 4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。显色 1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀； 2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

实验方法

WB

实验步骤：

样品制备

1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆。

2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。

3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。

4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；

5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；

6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。

电泳分离

1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表

2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）

转膜

1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；

2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；

3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；

4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表

湿转法参考条件：200 mA, 120 min。

（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）

封闭

1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；

2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；

3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

抗体孵育

1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；

2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；

3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；

4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

显色

1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；

2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

文献参考

Application Data

WB

Validated by Selleck

Lane 1: NIH/3T3, Lane 2: Neuro-2a, Lane 3: J774A.1, Lane 4: PC12