Acetyl-Histone H3 (Lys23) Antibody (Rabbit mAb) [E10E19]

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生物描述

特异性 Acetyl-Histone H3 (Lys23) Antibody (Rabbit mAb) [E10E19] 仅识别 Lys23 位点发生甲基化的内源性 Histone H3 总蛋白水平。
背景 乙酰化组蛋白H3（Lys23），通常表示为H3K23ac，是组蛋白H3 N端尾部的一种特异性翻译后修饰，由组蛋白赖氨酸乙酰转移酶生成，并由组蛋白去乙酰化酶去除。它参与调控染色质结构和基因转录的广泛表观遗传程序。组蛋白H3包含一个球状核心结构域和一个延伸的尾部，尾部含有多个可修饰的赖氨酸残基，包括Lys4、9、14、18、23、27、36和56。这些位点的乙酰化会中和赖氨酸侧链的正电荷，从而减少组蛋白尾部与DNA骨架之间的静电相互作用，并削弱核小体间的接触，最终促进染色质形成更开放的构象。 Lys23 的乙酰化符合这一普遍机制，它有助于染色质松弛，并使包括转录因子和共激活因子在内的 DNA 结合蛋白更有效地结合核小体区域内的靶序列，从而促进转录机制接近 DNA。组蛋白 H3 上的乙酰化赖氨酸残基，包括 H3K23ac，也为含有溴结构域或 YEATS 结构域的阅读蛋白提供识别位点；这些阅读蛋白将额外的转录调控因子、染色质重塑因子或共激活因子复合物募集到乙酰化的核小体上，从而将 H3 尾部乙酰化整合到多步骤信号级联中，增强转录激活。在表观遗传组蛋白 H3 通路中，H3K23ac 与其他乙酰化标记一起参与协调核组织和染色质结构域状态，作为组合式 PTM 模式的一部分，将活性启动子、增强子和转录激活的基因体与抑制区域区分开来。在癌症中，组蛋白H3乙酰化的整体变化，包括尾部乙酰化的改变，与基因表达的改变密切相关。乙酰化失调通过改变控制细胞增殖、凋亡和DNA修复的位点的可及性，促进致癌信号传导。组蛋白乙酰化水平，例如通过抗乙酰化H3K23抗体等位点特异性抗体进行评估，已被探索作为预后指标和HDAC抑制剂治疗的药效学指标。在结构层面，H3K23ac标记可以通过修饰特异性抗体进行监测。这些抗体仅识别Lys23乙酰化的组蛋白H3，且不与其他乙酰化赖氨酸发生交叉反应。这些抗体可用于染色质免疫沉淀、免疫组织化学或蛋白质印迹等方法，以绘制或定量H3K23ac在基因组和组织中的分布。

使用信息

抗体应用 WB, IF, ChIP 稀释比例
WB IF ChIP
1:1000 1:2000 1:800
反应性 Mouse, Human
抗体类型 Rabbit Monoclonal Antibody MW 15 kDa
储存液配方 PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3
储存条件
(自收到货起)		 -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years
WB
实验步骤：
 
样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/Nuclear Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。
2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/Nuclear Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。
3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/Nuclear Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。
4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
 
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：20 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表
2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
 
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；
4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.22 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表
湿转法参考条件：200 mA, 60 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
 
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
 
抗体孵育
1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；
2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
 
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
 
IF
实验步骤：
样品准备
1. 贴壁细胞：取洁净无菌盖玻片置于培养皿中，待细胞接近长成单层后取出盖玻片。
2. 悬浮细胞：将细胞接种至多聚赖氨酸包被的洁净无菌载玻片上。
3. 冰冻切片：将玻片置于室温下解冻，纯水或 PBS 摇洗 3次，每次 3 min。
4. 石蜡切片：先将玻片脱蜡至水，纯水或 PBS 摇洗 3次，每次 3 min。然后进行抗原修复。
 
固定
1. 使用固定液，如4%多聚甲醛（4% PFA）室温固定细胞爬片/涂片或组织切片 10~15 min。
2. 使用 PBS 摇洗样品 3次，每次 3 min。
 
通透
1. 对样品添加去垢剂，如 0.1~0.3% Triton X-100，室温通透 10~20 min。
（仅针对胞内抗原，若是细胞膜上表达的抗原则可省略该步骤。）
2. 使用 PBS 摇洗样品 3次，每次 3 min。
 
封闭
添加封闭液，在室温下封闭至少 1 h。（常用的封闭液包括：与二抗同一来源的血清、BSA或山羊血清。）
注意事项：从封闭开始之后的所有步骤务必保证样品湿润，避免干燥，否则极易产生高背景。
 
免疫荧光染色（第一天）
1. 吸走封闭液，滴加稀释后的一抗。
2. 湿盒中 4°C 孵育过夜。
 
免疫荧光染色（第二天）
1. 吸走一抗，PBST 摇洗 3 次，每次 5 min。
2. 滴加稀释后的荧光二抗，避光 4°C 孵育 1~2 h。
3. 吸走二抗，PBST 摇洗 3 次，每次 5 min。
4. 滴加稀释后的 DAPI，室温避光 孵育 5~10 min。
5. PBST 中摇洗 3 次，每次 5 分钟。
 
封片
1. 抗荧光淬灭封片剂封片。
2. 干燥玻片，将玻片置于室温下避光过夜。
3. 将载玻片放入玻片盒中 4°C 避光保存。
 

Application Data

WB

Validated by Selleck

  • Lane 1: HeLa, Lane 2: HeLa (Trichostatin A, 500 ng/ml, 4 h)