ADRA1B Antibody (Rabbit mAb) [C3A12]

目录号：F2416

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生物描述

特异性 ADRA1B Antibody (Rabbit mAb) [C3A12] 可检测内源性 ADRA1B 总蛋白水平。
背景 α1B肾上腺素能受体（ADRA1B）是α1-肾上腺素能受体家族中的AG类蛋白偶联受体，主要与Gq/11蛋白偶联，并通过磷脂酰肌醇-钙第二信使信号通路介导儿茶酚胺依赖性血管收缩、心脏调节和中枢单胺能控制。该受体具有典型的七个跨膜螺旋，胞外环形成去甲肾上腺素和肾上腺素的正构结合口袋，胞内区域与Gq/11和β-arrestin相互作用；近期对人α1B受体与反向激动剂(+)-环唑嗪结合的高分辨率晶体结构和冷冻电镜结构揭示了亚型选择性配体识别的分子决定因素，包括跨膜束和胞外前庭中的特定残基，这些残基决定了受体对胺能药物的亲和力和选择性。对α1B的实验和计算诱变已鉴定出参与受体激活和Gq偶联的关键残基，功能研究表明，受体结合可激活磷脂酶C-β，导致肌醇三磷酸生成、细胞内Ca²⁺动员和血管床平滑肌收缩，这表明ADRA1B是外周血管收缩和血压调节的主要贡献者。缺乏α1B的基因敲除小鼠模型表现出血管收缩反应减弱、血压调节改变、葡萄糖稳态改变以及对滥用药物的奖赏反应改变，表明ADRA1B整合了心血管和代谢信号与多巴胺能奖赏回路。在中枢神经系统中，主要由肾上腺素支配的α1B肾上腺素能受体亚群被认为构成了一个“EPI-α1系统”，该系统平行调节血清素能、去甲肾上腺素能和多巴胺能通路；动物模型和临床数据表明，α1系统的损伤或抑制会导致抑郁表型，而多种抗抑郁药恢复α1B介导的信号传导与行为激活的改善相关，这使得ADRA1B成为情绪障碍的潜在靶点。ADRA1B的人类遗传变异会影响血管反应：一项关于ADRA1B多态性和手背静脉收缩的研究表明，特定等位基因与肾上腺素能血管收缩的个体间和种族差异相关，这支持了ADRA1B变异在易感高血压和其他血管特征中的作用。关联分析还表明，在更广泛的去甲肾上腺素能基因定位中，罕见的ADRA1B单倍型与注意力缺陷/多动障碍相关，这进一步强化了α1B介导的去甲肾上腺素信号传导对神经精神疾病风险的贡献。

使用信息

抗体应用 WB, IHC 稀释比例
WB IHC
1:1000 - 1:10000 1:500
反应性 Mouse, Rat, Human
抗体类型 Rabbit Monoclonal Antibody MW 57 kDa
储存液配方 PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3
储存条件
(自收到货起)		 -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years
WB
实验步骤：
 
样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。
2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。
3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。
4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
 
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表
2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
 
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；
4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表
湿转法参考条件：200 mA, 120 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
 
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
 
抗体孵育
1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；
2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
 
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
 
IHC
实验步骤：
 
脱蜡/补液
1. 脱蜡/水合切片：
2. 将切片在二甲苯中孵育 3 次，每次 5 分钟。
3. 将切片在 100% 乙醇中孵育两次，每次 10 分钟。
4. 将切片在 95% 乙醇洗涤液中孵育两次，每次 10 分钟。
5. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
6.抗原修复：对于柠檬酸盐：将载玻片浸入 1X 柠檬酸盐暴露溶液中，在微波炉中加热，直至开始沸腾； 在亚沸温度 (95°-98°C) 下继续煮 10 分钟。 在工作台上冷却玻片 30 分钟。
 
染色
1. 用 dH2O 清洗切片 3 次，每次 5 分钟。
2. 将切片在 3% 过氧化氢中孵育 10 分钟。
3. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
4. 在洗涤缓冲液中洗涤切片 5 分钟。
5. 用 100–400 µl 封闭液在室温下封闭每个切片 1 小时。
6. 除去封闭液，并向每个切片中添加 100–400 µl 一抗稀释液。 4°C 孵育过夜。
7. 去除抗体溶液，用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
8. 用 1-3 滴所需的 HRPA 覆盖切片。 在加湿室中室温孵育 30 分钟。
9. 用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
10. 使用前将 DAB 显色剂浓缩液加入 DAB 稀释液中并充分混合。
11. 在每个切片上涂抹 100–400 µl DAB 并密切监测。 1-10 分钟通常可提供可接受的染色强度。
12. 将载玻片浸入 dH2O 中。
13. 如果需要，用苏木精复染切片。
14. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
15. 切片脱水：95%乙醇孵育切片两次，每次 10 秒； 在 100% 乙醇中重复，孵育切片两次，每次 10 秒； 在二甲苯中重复，孵育切片两次，每次 10 秒。
16. 用盖玻片和封固剂封固切片。
 

Application Data

WB

Validated by Selleck

  • Lane 1: PC-3, Lane 2: NIH/3T3, Lane 3: Hela, Lane 4: Mouse brain