目录号：F1644

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生物描述

特异性

仅当 AKT1 Ser473 + AKT2 Ser 474 + AKT3 Ser 472 位点磷酸化时 AKT1 + AKT2 + AKT3 (phospho Ser 473 + Ser 474 + Ser 472) Rabbit mAb 才检测内源性 AKT1/ AKT2/ AKT3 总的磷酸化蛋白水平。
背景

Akt，也称为蛋白激酶 B (PKB)，是 AGC 激酶家族的成员，该家族还包括 S6K、RSK、SGK 和 PKC 等激酶。包括 Akt 在内的该家族的一个特征是两个关键位点的磷酸化：催化域中的活化环 (T 环) 和 C 端的疏水基序 (HM)。Akt2 是一种丝氨酸-苏氨酸激酶，属于 Akt/PKB 原癌基因家族。Akt1 和 Akt2 均作为磷脂酰肌醇 3-激酶 (PI3K) 下游的信号转导子发挥作用。尽管它们由不同的基因编码，但 Akt1 和 Akt2 在其羧基末端区域差异最大。Akt1 对调控糖原代谢以及控制细胞生长和存活至关重要。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白 (mTOR) 通过两种复合物在细胞生长和增殖中发挥作用：raptor-mTOR (TORC1) 和 rictor-mTOR (TORC2)。TORC2 已被确定为难以捉摸的 PDK2，它负责在疏水基序的 Ser473 处磷酸化 Akt/PKB。这种磷酸化以及活化环中的 Thr308 对 Akt 的正确活化和功能发挥至关重要。

使用信息

抗体应用 WB, IP, IF 稀释比例
WB IP IF
1:1000 1:50 1:100
反应性 Human, Mouse, Rat
抗体类型 Rabbit MW 56 kDa
储存液配方 PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3
储存条件
(自收到货起)		 –20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years
WB
Western Blotting
 
样品制备
1. 吸去培养基,用1X PBS清洗细胞。
2. 加入1X SDS上样缓冲液裂解细胞,将提取物转移至微量离心管中。置于冰上。
3. 超声10–15秒,完成细胞裂解和DNA剪切。
4. 将20 µl样品在95–100°C加热5分钟,然后置于冰上冷却。
5. 离心5分钟(使用微量离心机)。
6. 将适量样品上样至SDS-PAGE凝胶(上样量取决于提取蛋白浓度)。注意:同时请上样预染分子量标准,以确定分子量并验证电转效果。
7. 电转至硝酸纤维素膜/PVDF膜。(湿转法参考条件: 150mA 120min)
 
膜封闭与抗体孵育
a. 封闭
1. (可选)转膜完成后,用TBS室温洗膜5分钟。
2. 将膜在封闭液中室温孵育1小时。
3. 用TBST洗涤3次,每次5分钟。
 
b. 抗体孵育
1. 将膜与一抗(按推荐的稀释度和稀释液配制)置于一抗稀释缓冲液中,4°C温和摇床过夜孵育。
2. 用TBST洗涤3次,每次5分钟。
3. 将膜与适当的二抗(稀释于封闭液中)在室温下温和摇床孵育1小时。
4. 用TBST洗涤3次,每次5分钟。
5. 进行检测。
 
显影检测
1. 抗体孵育结束后,用TBST洗膜3次,每次5分钟。
2. 配制ECL发光试剂(或根据二抗类型选择其他显色剂/底物)。混匀。
3. 将底物与膜孵育1分钟,去除多余溶液(膜保持湿润),置于显影仪中进行曝光。
IF
实验步骤：
 
标本制备
1. 吸出液体，然后用 1X PBS 稀释的 4% 多聚甲醛覆盖细胞至 2-3 mm 的深度。
注意：多聚甲醛有毒，只能在通风橱中使用。
2. 室温固定细胞 15 分钟。
3. 吸出固定液，用 1X PBS 冲洗 3 次，每次 5 分钟。
4. 继续进行免疫染色。
 
免疫染色
1. 添加封闭缓冲液并在室温下孵育 60 分钟。
2. 按照建议在抗体稀释缓冲液中制备一抗稀释液。
3. 吸出封闭液，加入制备好的一抗稀释液。
4. 4°C 孵育过夜。
5. 在 1X PBS 中冲洗 3 次，每次 5 分钟。
6. 将样本放入用抗体稀释缓冲液稀释的荧光染料偶联二抗中，室温避光孵育 1-2 小时。
7. 在 1X PBS 中冲洗 3 次，每次 5 分钟。
8. 使用带有 DAPI 的封固剂封固载玻片并盖上盖玻片。
9. 为获得最佳效果，请让封固剂在室温下固化过夜。 如需长期保存，请将载玻片平放在 4°C 避光保存。
 

Application Data

WB

Validated by Selleck

  • Lane 1: LNCaP
    Lane 2: LNCaP (Calyculin A, 0.1µM, 30 min)