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生物描述

特异性

AMPK alpha 1 (phospho T183) + AMPK alpha 2  (phospho T172) Rabbit mAb 可检测内源性总 AMPK alpha 1/2 的蛋白水平。
背景

AMP 活化蛋白激酶 (AMPK) 是一种高度保守的酶，存在于从酵母到植物和动物的各种物种中，在维持细胞内能量平衡方面发挥着至关重要的作用。AMPK 以异三聚体复合物的形式发挥作用，该复合物由催化 α 亚基和调控 β 和 γ 亚基组成，由多个基因编码（α1、α2；β1、β2；γ1、γ2、γ3）。激酶在 AMP/ATP 比率增加时被激活，这种情况发生在细胞和环境应激条件下，例如热休克、缺氧和缺血。AMPK 和雷帕霉素复合物 1 的机制靶点 (mTORC1) 是关键的代谢激酶，可使营养物质的利用与细胞生长同步。AMPK 抑制 mTORC1，而 mTORC1 反过来在两种 α 同工型上的特定位点 (S345/7) 磷酸化 AMPK。 AMPK 不仅调控脂肪酸和糖原代谢，还通过 EF2 和 TSC2/mTOR 通路影响蛋白质合成和细胞生长，并通过 eNOS/nNOS 信号传导调控血流。AMPK 的激活需要 Thr172 处的 α 亚基磷酸化，这是肿瘤抑制因子 LKB1 与辅助蛋白 STRAD 和 MO25 共同进行的修饰。

使用信息

抗体应用 WB 稀释比例
WB
1:1000
反应性 Human, Mouse, Rat, D. melanogaster
抗体类型 Rabbit MW 64 kDa
储存液配方 PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3
储存条件
(自收到货起)		 –20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years
WB
Western Blotting
 
样品制备
1. 吸去培养基,用1X PBS清洗细胞。
2. 加入1X SDS上样缓冲液裂解细胞,将提取物转移至微量离心管中。置于冰上。
3. 超声10–15秒,完成细胞裂解和DNA剪切。
4. 将20 µl样品在95–100°C加热5分钟,然后置于冰上冷却。
5. 离心5分钟(使用微量离心机)。
6. 将适量样品上样至SDS-PAGE凝胶(上样量取决于提取蛋白浓度)。注意:同时请上样预染分子量标准,以确定分子量并验证电转效果。
7. 电转至硝酸纤维素膜/PVDF膜。(湿转法参考条件: 150mA 120min)
 
膜封闭与抗体孵育
a. 封闭
1. (可选)转膜完成后,用TBS室温洗膜5分钟。
2. 将膜在封闭液中室温孵育1小时。
3. 用TBST洗涤3次,每次5分钟。
 
b. 抗体孵育
1. 将膜与一抗(按推荐的稀释度和稀释液配制)置于一抗稀释缓冲液中,4°C温和摇床过夜孵育。
2. 用TBST洗涤3次,每次5分钟。
3. 将膜与适当的二抗(稀释于封闭液中)在室温下温和摇床孵育1小时。
4. 用TBST洗涤3次,每次5分钟。
5. 进行检测。
 
显影检测
1. 抗体孵育结束后,用TBST洗膜3次,每次5分钟。
2. 配制ECL发光试剂(或根据二抗类型选择其他显色剂/底物)。混匀。
3. 将底物与膜孵育1分钟,去除多余溶液(膜保持湿润),置于显影仪中进行曝光。

Application Data

WB

Validated by Selleck

  • Lane 1: HEK-293
    Lane 2: Mouse heart
    Lane 3: Rat brain