ANK-3 Antibody (Mouse mAb) [F22J23]

目录号：F3938

打印

生物描述

特异性 ANK-3 Antibody (Mouse mAb) [F22J23] 可检测内源性 ANK-3 总蛋白水平。
背景 由ANK-3基因编码的锚蛋白G（Ankyrin-G）是锚蛋白家族的成员，该家族是一类模块化支架蛋白，可将特定的整合膜蛋白连接到肌动蛋白-血影蛋白细胞骨架上。锚蛋白G在轴突起始段和郎飞氏结高度富集，并在这些部位组织启动和传导动作电位所需的特殊兴奋性结构域。该蛋白包含一个由多个锚蛋白重复序列组成的N端膜结合结构域，可识别离子通道和黏附分子中的胞质基序；一个连接βIV-血影蛋白和膜下肌动蛋白网络的中央血影蛋白结合区；以及一个可发生磷酸化和其他修饰的C端调控尾。这些结构共同构成了一个柔性支架，可稳定特定轴突节段上的大型大分子复合物。在轴突起始段，锚蛋白-G 是电压门控钠通道（如 Nav1.6 和 Nav1.2）与粘附分子神经粘连蛋白-186 和 NrCAM 聚集所必需的；锚蛋白-G 的条件性缺失会分散这些通道和粘附蛋白，消除高密度钠通道簇，并消除正常的动作电位发放，这表明锚蛋白-G 是 AIS 兴奋性的重要组织者，而不是被动的系绳。轴突起始段（AIS）和郎飞氏结中锚蛋白G依赖性结构域的组装机制不同：AIS的形成本质上是由锚蛋白G的早期积累决定的，锚蛋白G通过其胞内尾部募集神经黏附蛋白-186，并支持钠通道从内向外聚集到膜上；而周围神经系统郎飞氏结则由雪旺氏细胞信号决定，雪旺氏细胞信号通过其胞外结构域将神经黏附蛋白-186靶向到结节轴膜，随后从外向内募集锚蛋白G和钠通道，从而定义了不同的由内向外和由外向内的组装途径，这两种途径都汇聚于锚蛋白G作为中心支架。锚蛋白G不仅能聚集钠通道，还能直接调节它们的门控；锚蛋白-G与Nav1.6共表达可降低持续性钠电流，而锚蛋白-B则无此作用。嵌合体实验表明，锚蛋白-G的膜结合域对这种效应至关重要，这表明锚蛋白-G除了调控通道的空间分布外，还能调节通道的生物物理特性。在发育中的郎飞氏结，巨型锚蛋白-G亚型与神经黏附蛋白、NrCAM和Nav通道在肌动蛋白-血影蛋白网络的特定片段内共聚集，勾勒出早期郎飞氏结中间体，这些中间体最终成熟为功能完整的郎飞氏结。这种支架结构还形成了一个扩散屏障，通过限制胞体树突蛋白进入轴突来维持轴突的特性。锚蛋白G以多种组织特异性剪接变体表达，包括特异性靶向轴突起始段（AIS）和轴突末梢节点的巨型神经元亚型，以及存在于上皮细胞间连接处和细胞内膜的较短亚型。这些较短亚型锚定黏附复合物，并可能调节极化运输，从而将锚蛋白G的作用扩展到经典的神经元兴奋性之外，并延伸至更广泛的细胞结构方面。遗传和功能数据表明，ANK3/锚蛋白G与双相情感障碍和自闭症谱系障碍等神经精神疾病相关，这与AIS结构和钠离子通道聚集在塑造神经元放电模式和回路整合中的核心作用相一致。此外，锚蛋白G在可兴奋细胞区域中已确立的重要性也表明，当细胞骨架信号通路受到干扰时，该支架蛋白与心律失常和猝死有关。

使用信息

抗体应用 WB, IP, IF, ELISA 稀释比例
WB IF
1:1000 1:200-1:500
反应性 Dog, Human, Mouse, Rabbit, Rat
抗体类型 Mouse Monoclonal Antibody MW 480 kDa
储存液配方 PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3
储存条件
(自收到货起)		 -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years
WB
实验步骤：
 
样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。
2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。
3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。
4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
 
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：5 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表
2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
 
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；
4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表
湿转法参考条件：250 mA, 180 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
 
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
 
抗体孵育
1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；
2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
 
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
 
IF
实验步骤：
样品准备
1. 贴壁细胞：取洁净无菌盖玻片置于培养皿中，待细胞接近长成单层后取出盖玻片。
2. 悬浮细胞：将细胞接种至多聚赖氨酸包被的洁净无菌载玻片上。
3. 冰冻切片：将玻片置于室温下解冻，纯水或 PBS 摇洗 3次，每次 3 min。
4. 石蜡切片：先将玻片脱蜡至水，纯水或 PBS 摇洗 3次，每次 3 min。然后进行抗原修复。
 
固定
1. 使用固定液，如4%多聚甲醛（4% PFA）室温固定细胞爬片/涂片或组织切片 10~15 min。
2. 使用 PBS 摇洗样品 3次，每次 3 min。
 
通透
1. 对样品添加去垢剂，如 0.1~0.3% Triton X-100，室温通透 10~20 min。
（仅针对胞内抗原，若是细胞膜上表达的抗原则可省略该步骤。）
2. 使用 PBS 摇洗样品 3次，每次 3 min。
 
封闭
添加封闭液，在室温下封闭至少 1 h。（常用的封闭液包括：与二抗同一来源的血清、BSA或山羊血清。）
注意事项：从封闭开始之后的所有步骤务必保证样品湿润，避免干燥，否则极易产生高背景。
 
免疫荧光染色（第一天）
1. 吸走封闭液，滴加稀释后的一抗。
2. 湿盒中 4°C 孵育过夜。
 
免疫荧光染色（第二天）
1. 吸走一抗，PBST 摇洗 3 次，每次 5 min。
2. 滴加稀释后的荧光二抗，避光 4°C 孵育 1~2 h。
3. 吸走二抗，PBST 摇洗 3 次，每次 5 min。
4. 滴加稀释后的 DAPI，室温避光 孵育 5~10 min。
5. PBST 中摇洗 3 次，每次 5 分钟。
 
封片
1. 抗荧光淬灭封片剂封片。
2. 干燥玻片，将玻片置于室温下避光过夜。
3. 将载玻片放入玻片盒中 4°C 避光保存。
 

Application Data

WB

Validated by Selleck

  • Lane 1: SH-ST5T, Lane 2: U-87MG, Lane 3: Mouse brain