Anti-14-3-3 γ Rabbit Antibody [J16F21] Datasheet

生物描述

特异性	Anti-14-3-3 γ Rabbit Antibody [J16F21] 可检测内源性总 14-3-3γ 的蛋白水平。该抗体不会与其他哺乳动物 14-3-3 同工型发生交叉反应，并且理论上也可以检测其他物种（包括青蛙和鱼）中的 14-3-3γ 直系同源物。
背景	14-3-3γ 是一种丰富的脑蛋白，也是 14-3-3 家族的七种异构体之一，由 247 个氨基酸组成。它具有二聚体结构，每个原体含有九个反向平行 α-螺旋。14-3-3γ 与各种靶蛋白上的磷酸化丝氨酸/苏氨酸基序结合，作为支架来调控它们的活性、定位、稳定性或相互作用。它参与关键的细胞过程，如信号转导、细胞周期进程、细胞凋亡、应激反应和代谢。14-3-3γ 可以与其他同工型（如 14-3-3ε）形成异二聚体，选择性地结合特定靶标，如上皮钠通道 (ENaC)。Ser58 处的磷酸化会影响其二聚化和靶标结合。14-3-3γ 保护 KSR1 免于去磷酸化，维持 ERK2 活化，并稳定 DAPK2 二聚化，同时抑制 Ca²⁺/CaM 结合，影响细胞信号传导和应激反应。14-3-3γ 充当支架以募集 Chk1 和 Cdc25A，促进 Chk1 介导的 Cdc25A 在 S76 处的磷酸化，从而导致其多泛素化和随后的蛋白酶体依赖性降解。

特异性

Anti-14-3-3 γ Rabbit Antibody [J16F21] 可检测内源性总 14-3-3γ 的蛋白水平。该抗体不会与其他哺乳动物 14-3-3 同工型发生交叉反应，并且理论上也可以检测其他物种（包括青蛙和鱼）中的 14-3-3γ 直系同源物。

背景

14-3-3γ 是一种丰富的脑蛋白，也是 14-3-3 家族的七种异构体之一，由 247 个氨基酸组成。它具有二聚体结构，每个原体含有九个反向平行 α-螺旋。14-3-3γ 与各种靶蛋白上的磷酸化丝氨酸/苏氨酸基序结合，作为支架来调控它们的活性、定位、稳定性或相互作用。它参与关键的细胞过程，如信号转导、细胞周期进程、细胞凋亡、应激反应和代谢。14-3-3γ 可以与其他同工型（如 14-3-3ε）形成异二聚体，选择性地结合特定靶标，如上皮钠通道 (ENaC)。Ser58 处的磷酸化会影响其二聚化和靶标结合。14-3-3γ 保护 KSR1 免于去磷酸化，维持 ERK2 活化，并稳定 DAPK2 二聚化，同时抑制 Ca²⁺/CaM 结合，影响细胞信号传导和应激反应。14-3-3γ 充当支架以募集 Chk1 和 Cdc25A，促进 Chk1 介导的 Cdc25A 在 S76 处的磷酸化，从而导致其多泛素化和随后的蛋白酶体依赖性降解。

使用信息

抗体应用

WB

稀释比例

WB

1:1000

反应性

Human, Mouse, Rat, Monkey, Pig, Chicken, Xenopus, Zebrafish

抗体类型

Rabbit

MW

27 kDa

储存液配方

PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN₃

储存条件
(自收到货起)

–20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years

实验方法
WB	实验步骤：样品制备 1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 将细胞转移至EP管中。用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声破碎，冰上静置裂解 30 min。冰上静置裂解 5 min。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液； 5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度； 6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。电泳分离 1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）转膜 1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中； 2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗； 3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表湿转法参考条件：200 mA, 60 min。（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）封闭 1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min； 2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温； 3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。抗体孵育 1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min； 3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h； 4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。显色 1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀； 2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

实验方法

WB

实验步骤：

样品制备

1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。

2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 将细胞转移至EP管中。用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声破碎，冰上静置裂解 30 min。冰上静置裂解 5 min。

3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。

4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；

5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；

6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。

电泳分离

1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表

2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）

转膜

1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；

2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；

3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；

4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表

湿转法参考条件：200 mA, 60 min。

（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）

封闭

1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；

2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；

3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

抗体孵育

1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；

2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；

3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；

4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

显色

1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；

2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

文献参考

Application Data

WB

Validated by Selleck

Lane 1: Hela
Lane 2: A431
Lane 3: COS7
Lane 4: 3T3

IHC

Validated by Selleck

Immunohistochemical analysis of formalin fixed paraffin embedded human breast cancer tissue with F1473 at 1/100 dilution.