Anti-Bok Rabbit Antibody [D23N7]

目录号：F3632

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生物描述

特异性

Anti-Bok Rabbit Antibody [D23N7] 可检测内源性 Bok 总蛋白水平。
背景 Bcl-2 蛋白家族由进化保守的成员组成，这些成员含有 Bcl-2 同源性 (BH) 结构域，通过调节线粒体膜通透性和控制细胞色素 c 的释放来调控细胞凋亡。根据序列相似性和功能特性，该家族可分为三个亚组：促存活蛋白（Bcl-2、Bcl-xL、Mcl-1、A1 和 Bcl-w）、促凋亡效应蛋白（Bax、Bak 和 Bok）以及仅含 BH3 的蛋白（Bad、Bik、Bid、Puma、Bim、Bmf、Noxa 和 Hrk）。Bok 最初是通过其序列同源性及其与特定抗凋亡家族成员的相互作用而发现的。它在卵巢、睾丸和子宫等生殖组织中表达最为丰富，但也存在于各种成体和发育组织中。 Bok基因在人类癌症中的频繁突变表明其可能具有抑癌功能。尽管Bok在结构上与促凋亡蛋白Bax和Bak相似，但它在功能上表现出差异，尤其是在介导内质网（ER）应激引发的细胞凋亡方面。Bok的稳定性受到内质网相关降解（ERAD）通路的严格调控。蛋白酶体的抑制会增加Bok的表达，在这种情况下，Bok可以引发细胞凋亡。

使用信息

抗体应用 WB, FCM 稀释比例
WB FCM
1:1000 1:50
反应性 Mouse, Rat, Human
抗体类型 Rabbit MW 23 kDa
储存液配方 PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3
储存条件
(自收到货起)		 -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years
WB
实验步骤：
 
样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆。
2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。
3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。
4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
 
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表
2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
 
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；
4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表
湿转法参考条件：200 mA, 60 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
 
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
 
抗体孵育
1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；
2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
 
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
 

Application Data