Anti-Cathepsin B Rabbit Antibody [F22P14] Datasheet

生物描述

特异性	Anti-Cathepsin B Rabbit Antibody [F22P14] 用于检测内源性 Cathepsin B 总的蛋白水平。
背景	Cathepsin B是一种溶酶体半胱天冬酶，属于木瓜蛋白酶家族。它最初以339个氨基酸的前酶形式合成，其中包含17个氨基酸的信号肽。该前体经过加工形成成熟酶，分子量为30 kDa，由一个25–26 kDa的重链和一个5 kDa的轻链通过二硫键连接。酶的催化三联体由Cys29、His199和Asp219组成，使其具有内肽酶和肽酰二肽酶活性。一个独特的封闭环（Pro107–Asp124）通过盐桥（His110–Asp22，Arg116–Asp224）稳定酶，并调节其在酸性条件下的羧肽酶活性，而在中性pH时则转向内肽酶活性。在高尔基体中的翻译后糖基化使得猫hepsin B带有甘露糖-6-磷酸，指引其进入溶酶体。进入溶酶体后，酸性pH触发酶的自催化激活。它还表现出连接酶活性，在特定条件下通过反向蛋白水解合成肽。它在凋亡中发挥重要作用，通过切割Bid促进线粒体细胞色素c的释放。Cathepsin B还通过释放从白蛋白降解中得到的半胱氨酸，促进谷胱甘肽的合成，影响铁死亡。病理上，cathepsin B参与癌症转移，通过降解细胞外基质、导致类风湿关节炎中的炎症性关节损伤，并通过激活蛋白水解级联反应（如将前uPA转化为uPA，分解胶原）参与心血管重塑。

特异性

Anti-Cathepsin B Rabbit Antibody [F22P14] 用于检测内源性 Cathepsin B 总的蛋白水平。

背景

Cathepsin B是一种溶酶体半胱天冬酶，属于木瓜蛋白酶家族。它最初以339个氨基酸的前酶形式合成，其中包含17个氨基酸的信号肽。该前体经过加工形成成熟酶，分子量为30 kDa，由一个25–26 kDa的重链和一个5 kDa的轻链通过二硫键连接。酶的催化三联体由Cys29、His199和Asp219组成，使其具有内肽酶和肽酰二肽酶活性。一个独特的封闭环（Pro107–Asp124）通过盐桥（His110–Asp22，Arg116–Asp224）稳定酶，并调节其在酸性条件下的羧肽酶活性，而在中性pH时则转向内肽酶活性。在高尔基体中的翻译后糖基化使得猫hepsin B带有甘露糖-6-磷酸，指引其进入溶酶体。进入溶酶体后，酸性pH触发酶的自催化激活。它还表现出连接酶活性，在特定条件下通过反向蛋白水解合成肽。它在凋亡中发挥重要作用，通过切割Bid促进线粒体细胞色素c的释放。Cathepsin B还通过释放从白蛋白降解中得到的半胱氨酸，促进谷胱甘肽的合成，影响铁死亡。病理上，cathepsin B参与癌症转移，通过降解细胞外基质、导致类风湿关节炎中的炎症性关节损伤，并通过激活蛋白水解级联反应（如将前uPA转化为uPA，分解胶原）参与心血管重塑。

使用信息

抗体应用

WB, IHC, IF, FCM

稀释比例

WB	IHC	IF	FCM
1:1000	1:1000	1:250	1:500

反应性

Mouse, Rat

抗体类型

Rabbit

MW

38 kDa

储存液配方

PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3

储存条件
(自收到货起)

-20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years

实验方法
WB	实验步骤：样品制备 1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 将细胞转移至EP管中。用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声破碎，冰上静置裂解 30 min。冰上静置裂解 5 min。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液； 5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度； 6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。电泳分离 1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）转膜 1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中； 2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗； 3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表湿转法参考条件：200 mA, 60 min。（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）封闭 1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min； 2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温； 3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。抗体孵育 1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min； 3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h； 4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。显色 1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀； 2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

实验方法

WB

实验步骤：

样品制备

1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。

2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 将细胞转移至EP管中。用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声破碎，冰上静置裂解 30 min。冰上静置裂解 5 min。

3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。

4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；

5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；

6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。

电泳分离

1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表

2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）

转膜

1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；

2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；

3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；

4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表

湿转法参考条件：200 mA, 60 min。

（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）

封闭

1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；

2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；

3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

抗体孵育

1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；

2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；

3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；

4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

显色

1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；

2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

Anti-Cathepsin B Rabbit Antibody [F22P14]

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