Anti-Cdc27 Mouse Antibody [F8A11] Datasheet

生物描述

特异性	Anti-Cdc27 Mouse Antibody [F8A11] 用于检测内源性 Cdc27 总的蛋白水平。
背景	Cdc27 是有丝分裂促进复合物/周期体（APC/C）中的关键亚基，该复合物是一个大型的 E3 泛素连接酶，调控细胞周期的进程，尤其在有丝分裂阶段。Cdc27 属于含有 TPR（四螺旋重复结构）结构域的亚基，是 APC/C 结构和功能的重要组成部分。其结构由13个 TPR 重复单元组成，形成同源二聚体结构，这对于其在 APC/C 中的功能至关重要。Cdc27 能够通过与辅助激活因子（如 Cdc20 和 Cdh1）以及 Apc10/Doc1 的 C 端 IR 基序相互作用，促进这些因子的结合，从而实现底物的识别与泛素化。这一过程触发从中期到后期的转变以及有丝分裂的退出，主要通过降解如细胞周期蛋白和securin等关键调控因子来实现。Cdc27 的 N 端区域发生二聚化，形成的界面对于 APC/C 的催化活性必不可少。Cdc27 还在维持 APC/C 亚基的计量比和平衡多亚基相互作用方面发挥作用，从而影响复合物的组装和稳定性。Cdc27 的二聚作用对 APC/C 的整体功能至关重要，若该过程发生突变，可能导致细胞周期失调并促进癌症的发展。

特异性

Anti-Cdc27 Mouse Antibody [F8A11] 用于检测内源性 Cdc27 总的蛋白水平。

背景

Cdc27 是有丝分裂促进复合物/周期体（APC/C）中的关键亚基，该复合物是一个大型的 E3 泛素连接酶，调控细胞周期的进程，尤其在有丝分裂阶段。Cdc27 属于含有 TPR（四螺旋重复结构）结构域的亚基，是 APC/C 结构和功能的重要组成部分。其结构由13个 TPR 重复单元组成，形成同源二聚体结构，这对于其在 APC/C 中的功能至关重要。Cdc27 能够通过与辅助激活因子（如 Cdc20 和 Cdh1）以及 Apc10/Doc1 的 C 端 IR 基序相互作用，促进这些因子的结合，从而实现底物的识别与泛素化。这一过程触发从中期到后期的转变以及有丝分裂的退出，主要通过降解如细胞周期蛋白和securin等关键调控因子来实现。Cdc27 的 N 端区域发生二聚化，形成的界面对于 APC/C 的催化活性必不可少。Cdc27 还在维持 APC/C 亚基的计量比和平衡多亚基相互作用方面发挥作用，从而影响复合物的组装和稳定性。Cdc27 的二聚作用对 APC/C 的整体功能至关重要，若该过程发生突变，可能导致细胞周期失调并促进癌症的发展。

使用信息

抗体应用

WB, IHC, FCM

稀释比例

WB	IHC	FCM
1:250-1:500	1:250	1:20 - 1:50

反应性

Human, Mouse

抗体类型

Mouse

MW

91 kDa

储存液配方

PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3

储存条件
(自收到货起)

-20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years

实验方法
WB	实验步骤：样品制备 1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 将细胞转移至EP管中。用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声破碎，冰上静置裂解 30 min。冰上静置裂解 5 min。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液； 5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度； 6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。电泳分离 1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）转膜 1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中； 2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗； 3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表湿转法参考条件：200 mA, 120 min。（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）封闭 1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min； 2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温； 3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。抗体孵育 1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:250），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min； 3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h； 4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。显色 1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀； 2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

实验方法

WB

实验步骤：

样品制备

1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。

2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 将细胞转移至EP管中。用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声破碎，冰上静置裂解 30 min。冰上静置裂解 5 min。

3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。

4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；

5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；

6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。

电泳分离

1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表

2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）

转膜

1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；

2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；

3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；

4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表

湿转法参考条件：200 mA, 120 min。

（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）

封闭

1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；

2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；

3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

抗体孵育

1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:250），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；

2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；

3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；

4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

显色

1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；

2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

文献参考

Application Data

WB

Validated by Selleck

Lane 1: HeLa, Lane 2: 293, Lane 3: Mouse myeloid