Anti-FECH Rabbit Antibody [M13C12]

目录号：F3844

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生物描述

特异性

Anti-FECH Rabbit Antibody [M13C12] 可检测内源性 FECH 总蛋白水平。
背景 铁螯合酶 (FECH) 是血红素生物合成途径中的最终酶，负责催化亚铁 (Fe²⁺) 与原卟啉 IX 结合，最终生成血红素。FECH 锚定于线粒体内膜，对维持细胞血红素水平至关重要——血红素是氧气运输、电子转移和氧化还原平衡等过程所必需的辅助因子。该酶不仅完成血红素合成级联，也是铁代谢和卟啉调节之间的关键环节。FECH 活性通过与其磷酸化相关的信号级联上调，并由促红细胞生成素 (EPO) 触发。从结构上讲，FECH 含有一个铁硫 ([Fe–S]) 簇，这有助于其稳定性，并可能在氧化还原感应中发挥作用。线粒体转运蛋白 (mitoferrin) 促进铁向 FECH 的输送，线粒体转运蛋白是血红素高效组装所必需的线粒体转运蛋白。该酶由FECH基因编码，广泛表达于各组织，在红系细胞中含量最高，因为红系细胞在血红蛋白生成过程中对血红素的需求量很大。FECH基因突变可导致红细胞生成性原卟啉症(EPP)，这种疾病的特征是原卟啉的积累和对光的敏感性增强，这凸显了该酶的重要生理作用。

使用信息

抗体应用 WB 稀释比例
WB
1:1000 - 1:10000
反应性 Human
抗体类型 Rabbit MW 48 kDa
储存液配方 PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3
储存条件
(自收到货起)		 -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years
WB
实验步骤：
 
样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆。
2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。
3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。
4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
 
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表
2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
 
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；
4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表
湿转法参考条件：200 mA, 120 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
 
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
 
抗体孵育
1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；
2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
 
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
 

Application Data