Anti-GSK-3β Rabbit Antibody [H1F15]

目录号：F3534

打印

生物描述

特异性

Anti-GSK-3β Rabbit Antibody [H1F15] 可检测内源性 GSK-3β 总蛋白水平。
背景 糖原合酶激酶3 (GSK-3) 是一种广泛表达的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，存在两种亚型：GSK-3α 和 GSK-3β。这两种亚型的激酶结构域高度保守，但在 C 末端区域存在显著差异，GSK-3α 的 N 末端还具有富含甘氨酸的延伸。GSK-3 通过 Wnt 通路和其他各种信号级联在调节众多细胞过程中发挥核心作用。GSK-3β 已知能够影响多种细胞活动，包括细胞生长、分化、增殖、运动、凋亡、胚胎发生、细胞周期调控和胰岛素信号传导。它已被证实是多种细胞类型（例如神经元、肝细胞、成纤维细胞、内皮细胞和星形胶质细胞）在不同生理和病理条件下存活和死亡的关键调节因子。人类的GSK-3β蛋白由433个氨基酸组成，分子量约为46 kDa，而小鼠同源物则含有420个氨基酸。GSK-3β的活性受特定残基磷酸化的严格调控。Akt、p70S6激酶、p90RSK和PKC等激酶介导的丝氨酸9 (Ser-9)位点磷酸化会抑制其活性。相反，Fyn或ZAK1等激酶介导的酪氨酸216 (Tyr-216)位点磷酸化则会增强其催化功能。GSK-3β的关键靶点之一是β-catenin，GSK-3β会对其进行磷酸化，从而通过泛素-蛋白酶体通路导致β-catenin降解。当 GSK-3β 失活时（例如通过 Akt 介导的 Ser-9 位点磷酸化），β-catenin 会逃避降解，在细胞质中积累，并转位至细胞核，在那里激活基因转录。GSK-3β 还通过靶向细胞周期蛋白 D1 进行磷酸化，从而触发其快速降解，从而参与细胞周期调控。GSK-3β 活性失调与多种疾病有关，包括胰岛素抵抗和糖尿病、阿尔茨海默病和帕金森病等神经退行性疾病、精神分裂症和双相情感障碍等精神疾病以及各种癌症。值得注意的是，GSK-3β 可以作为肿瘤抑制因子或肿瘤促进因子发挥作用，具体取决于细胞环境和周围的信号传导环境，这突显了其在疾病生物学中复杂而多方面的作用。

使用信息

抗体应用 WB, IP, IHC 稀释比例
WB IP IHC
1:1000 1:50 1:100
反应性 Human, Mouse, Rat, Monkey
抗体类型 Rabbit MW 46 kDa
储存液配方 PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3
储存条件
(自收到货起)		 -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years
WB
实验步骤：
 
样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆。
2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。
3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。
4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
 
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表
2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
 
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；
4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表
湿转法参考条件：200 mA, 120 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
 
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
 
抗体孵育
1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；
2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
 
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
 
IHC
实验步骤：
 
脱蜡/补液
1. 脱蜡/水合切片：
2. 将切片在二甲苯中孵育 3 次，每次 5 分钟。
3. 将切片在 100% 乙醇中孵育两次，每次 10 分钟。
4. 将切片在 95% 乙醇洗涤液中孵育两次，每次 10 分钟。
5. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
6.抗原修复：对于柠檬酸盐：将载玻片浸入 1X 柠檬酸盐暴露溶液中，在微波炉中加热，直至开始沸腾； 在亚沸温度 (95°-98°C) 下继续煮 10 分钟。 在工作台上冷却玻片 30 分钟。
 
染色
1. 用 dH2O 清洗切片 3 次，每次 5 分钟。
2. 将切片在 3% 过氧化氢中孵育 10 分钟。
3. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
4. 在洗涤缓冲液中洗涤切片 5 分钟。
5. 用 100–400 µl 封闭液在室温下封闭每个切片 1 小时。
6. 除去封闭液，并向每个切片中添加 100–400 µl 一抗稀释液。 4°C 孵育过夜。
7. 去除抗体溶液，用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
8. 用 1-3 滴所需的 HRPA 覆盖切片。 在加湿室中室温孵育 30 分钟。
9. 用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
10. 使用前将 DAB 显色剂浓缩液加入 DAB 稀释液中并充分混合。
11. 在每个切片上涂抹 100–400 µl DAB 并密切监测。 1-10 分钟通常可提供可接受的染色强度。
12. 将载玻片浸入 dH2O 中。
13. 如果需要，用苏木精复染切片。
14. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
15. 切片脱水：95%乙醇孵育切片两次，每次 10 秒； 在 100% 乙醇中重复，孵育切片两次，每次 10 秒； 在二甲苯中重复，孵育切片两次，每次 10 秒。
16. 用盖玻片和封固剂封固切片。
 

Application Data