Anti-Insulin Rabbit Antibody [P22G21] Datasheet

生物描述

特异性	Anti-Insulin Rabbit Antibody [P22G21] 用于检测内源性 Insulin 总的蛋白水平。
背景	胰岛素是一种由胰腺β细胞产生的51氨基酸的激素，通过与胰岛素受体（IR）结合来调节葡萄糖稳态。胰岛素受体是一个由外部α亚基（负责配体结合）和跨膜β亚基（负责信号传导）组成的异四聚体酪氨酸激酶。胰岛素结合后，IR发生自磷酸化，激活其内源性激酶，磷酸化胰岛素受体底物（IRS），招募并激活PI3K，生成PIP3以激活AKT。AKT通过促进GLUT4转运来推动肌肉和脂肪组织的葡萄糖摄取，抑制肝脏的葡萄糖异生，通过磷酸化FOXO1抑制糖异生，促进糖原合成通过失活GSK3。胰岛素还通过PDE3B/ABHD15抑制ATGL/HSL来抑制脂解，并通过mTORC1刺激脂肪生成和蛋白质合成。胰岛素抵抗源于IR信号缺陷，包括受体密度减少、IRS磷酸化受损或PI3K/AKT通路中断，通常与慢性炎症、氧化应激或脂质代谢产物（如二酰甘油、神经酰胺）相关，这些代谢产物会抑制IRS-1和AKT。肝脏和肌肉中的异位脂质积累通过激活应激激酶（如JNK、PKCθ）进一步加剧胰岛素抵抗，这些激酶会通过丝氨酸磷酸化IRS，削弱胰岛素信号。线粒体功能障碍和内质网应激进一步损害葡萄糖代谢，助长高血糖和β细胞衰竭，导致2型糖尿病。

特异性

Anti-Insulin Rabbit Antibody [P22G21] 用于检测内源性 Insulin 总的蛋白水平。

背景

胰岛素是一种由胰腺β细胞产生的51氨基酸的激素，通过与胰岛素受体（IR）结合来调节葡萄糖稳态。胰岛素受体是一个由外部α亚基（负责配体结合）和跨膜β亚基（负责信号传导）组成的异四聚体酪氨酸激酶。胰岛素结合后，IR发生自磷酸化，激活其内源性激酶，磷酸化胰岛素受体底物（IRS），招募并激活PI3K，生成PIP3以激活AKT。AKT通过促进GLUT4转运来推动肌肉和脂肪组织的葡萄糖摄取，抑制肝脏的葡萄糖异生，通过磷酸化FOXO1抑制糖异生，促进糖原合成通过失活GSK3。胰岛素还通过PDE3B/ABHD15抑制ATGL/HSL来抑制脂解，并通过mTORC1刺激脂肪生成和蛋白质合成。胰岛素抵抗源于IR信号缺陷，包括受体密度减少、IRS磷酸化受损或PI3K/AKT通路中断，通常与慢性炎症、氧化应激或脂质代谢产物（如二酰甘油、神经酰胺）相关，这些代谢产物会抑制IRS-1和AKT。肝脏和肌肉中的异位脂质积累通过激活应激激酶（如JNK、PKCθ）进一步加剧胰岛素抵抗，这些激酶会通过丝氨酸磷酸化IRS，削弱胰岛素信号。线粒体功能障碍和内质网应激进一步损害葡萄糖代谢，助长高血糖和β细胞衰竭，导致2型糖尿病。

使用信息

抗体应用

WB, IHC, IF

稀释比例

WB	IHC	IF
1:1000	1:64000	1:200

反应性

Human, Mouse, Rat

抗体类型

Rabbit

MW

12 kDa

储存液配方

PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3

储存条件
(自收到货起)

-20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years

实验方法
WB	实验步骤：样品制备 1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/SDS/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 将细胞转移至EP管中。用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/SDS/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声破碎，冰上静置裂解 30 min。冰上静置裂解 5 min。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/SDS/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液； 5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度； 6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。电泳分离 1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：20 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）转膜 1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中； 2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗； 3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.22 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表湿转法参考条件：200 mA, 60 min。（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）封闭 1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min； 2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温； 3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。抗体孵育 1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min； 3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h； 4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。显色 1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀； 2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

实验方法

WB

实验步骤：

样品制备

1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/SDS/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。

2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 将细胞转移至EP管中。用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/SDS/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声破碎，冰上静置裂解 30 min。冰上静置裂解 5 min。

3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/SDS/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。

4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；

5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；

6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。

电泳分离

1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：20 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表

2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）

转膜

1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；

2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；

3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；

4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.22 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表

湿转法参考条件：200 mA, 60 min。

（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）

封闭

1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；

2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；

3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

抗体孵育

1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；

2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；

3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；

4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

显色

1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；

2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

文献参考

[1] Petersen MC, et al. Physiological reviews. 2018 Aug 1.

Application Data

WB

Validated by Selleck

Lane 1: Mouse pancreas, Lane 2: Rat pancreas