Anti-ITCH Rabbit Antibody [K4F16] Datasheet

生物描述

特异性	Anti-ITCH Rabbit Antibody [K4F16] 可检测内源性总 ITCH 的蛋白水平。
背景	ITCH 是一种含有 HECT 结构域的 E3 泛素连接酶，最初是在小鼠 Agouti 基因的遗传研究中发现的，该基因的突变会导致明显的皮毛颜色变化。有一种特殊的Agouti 基因突变，称为非致死性 Agouti 18H 突变，因其导致 Agouti 突变的小鼠发生免疫缺陷而受到关注。这种 18H 突变会导致皮毛颜色变深，通常是由辐射诱导的染色体倒位引起的，该倒位分别从近端和远端倒位断点删除了 18 个和 20 个碱基对，从而破坏了 Agouti 和 Itch 基因的表达。Itch 基因编码一种由 854 个氨基酸组成的蛋白质，分子量约为 113 kDa。ITCH 是一种单体 E3 泛素连接酶，属于 HECT 型家族，其特征是模块化结构，包括 N 端 Ca2+ 依赖性磷脂结合 C2 结构域、多个参与蛋白质-蛋白质相互作用的 WW 结构域和 C 端 HECT 结构域。HECT 结构域与特定的 E2 泛素结合酶相互作用，并含有高度保守的半胱氨酸残基，该残基在将泛素转移到靶蛋白之前与泛素形成硫酯键。 ITCH 包含四个 WW 结构域和一个位于残基 195 和 246 之间的独特脯氨酸富集区 (PRR)，这在其调控功能中起着至关重要的作用。ITCH 介导的泛素化超出了免疫信号通路的范围，针对 Hedgehog、Wnt/β-catenin、Hippo 和 Notch 信号通路中的关键调控因子，对细胞信号传导具有广泛影响。

特异性

Anti-ITCH Rabbit Antibody [K4F16] 可检测内源性总 ITCH 的蛋白水平。

背景

ITCH 是一种含有 HECT 结构域的 E3 泛素连接酶，最初是在小鼠 Agouti 基因的遗传研究中发现的，该基因的突变会导致明显的皮毛颜色变化。有一种特殊的Agouti 基因突变，称为非致死性 Agouti 18H 突变，因其导致 Agouti 突变的小鼠发生免疫缺陷而受到关注。这种 18H 突变会导致皮毛颜色变深，通常是由辐射诱导的染色体倒位引起的，该倒位分别从近端和远端倒位断点删除了 18 个和 20 个碱基对，从而破坏了 Agouti 和 Itch 基因的表达。Itch 基因编码一种由 854 个氨基酸组成的蛋白质，分子量约为 113 kDa。ITCH 是一种单体 E3 泛素连接酶，属于 HECT 型家族，其特征是模块化结构，包括 N 端 Ca2+ 依赖性磷脂结合 C2 结构域、多个参与蛋白质-蛋白质相互作用的 WW 结构域和 C 端 HECT 结构域。HECT 结构域与特定的 E2 泛素结合酶相互作用，并含有高度保守的半胱氨酸残基，该残基在将泛素转移到靶蛋白之前与泛素形成硫酯键。 ITCH 包含四个 WW 结构域和一个位于残基 195 和 246 之间的独特脯氨酸富集区 (PRR)，这在其调控功能中起着至关重要的作用。ITCH 介导的泛素化超出了免疫信号通路的范围，针对 Hedgehog、Wnt/β-catenin、Hippo 和 Notch 信号通路中的关键调控因子，对细胞信号传导具有广泛影响。

使用信息

抗体应用

WB, IP

稀释比例

WB	IP
1:1000	1:200

反应性

Human, Mouse, Rat

抗体类型

Rabbit

MW

105 kDa

储存液配方

PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN₃

储存条件
(自收到货起)

–20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years

实验方法
WB	实验步骤：样品制备 1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/SDS/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 将细胞转移至EP管中。用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/SDS/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声破碎，冰上静置裂解 30 min。冰上静置裂解 5 min。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/SDS/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液； 5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度； 6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。电泳分离 1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：5 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）转膜 1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中； 2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗； 3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表湿转法参考条件：200 mA, 120 min。（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）封闭 1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min； 2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温； 3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。抗体孵育 1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min； 3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h； 4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。显色 1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀； 2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

实验方法

WB

实验步骤：

样品制备

1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/SDS/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。

2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 将细胞转移至EP管中。用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/SDS/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声破碎，冰上静置裂解 30 min。冰上静置裂解 5 min。

3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/SDS/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。

4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；

5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；

6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。

电泳分离

1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：5 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表

2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）

转膜

1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；

2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；

3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；

4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表

湿转法参考条件：200 mA, 120 min。

（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）

封闭

1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；

2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；

3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

抗体孵育

1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；

2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；

3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；

4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

显色

1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；

2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

文献参考

[1] Melino G, et al. Cell Death Differ. 2008 Jul;15(7):1103-12.

Application Data

WB

Validated by Selleck

Lane 1: Ramos
Lane 2: Raji
Lane 3: NIH/3T3