Anti-p130 Cas Rabbit Antibody [P2F10] Datasheet

生物描述

特异性	Anti-p130 Cas Rabbit Antibody [P2F10] 用于检测内源性 p130 Cas 总的蛋白水平。基于序列同源性，该抗体不与其他SMC蛋白（包括SMC1、SMC2和SMC3）发生交叉反应。但仍可在约48 kDa处检测到一条未知来源的条带。
背景	p130Cas（也称为BCAR1）是一种多结构域支架蛋白和Src底物，在焦点粘附（FAs）中的整合素介导信号传导中起着核心作用，在其中调节细胞粘附、迁移、增殖、生存和肿瘤进展。它在哺乳动物细胞中普遍表达，尤其是在参与粘附和迁移的细胞中，并在多种癌症中（如乳腺癌）上调并超磷酸化，促进他莫昔芬耐药性。从结构上看，p130Cas包含一个N末端SH3结构域，可结合FAK等蛋白中的富含脯氨酸的基序，一个富含脯氨酸的区域（PRR），一个大的底物结构域（SD），含有15个YxxP基序， Src家族激酶磷酸化后招募SH2含量蛋白如Crk，一个富含丝氨酸的区域，以及一个C末端的Cas家族同源结构域（CCHD），可与paxillin LD1基序结合，结构上模仿FAK焦点粘附靶向结构域。SH3结构域和CCHD都对于将p130Cas靶向到焦点粘附至关重要，在那里它的磷酸化启动下游信号级联反应，这些反应对于细胞骨架重塑和致癌过程至关重要。

特异性

Anti-p130 Cas Rabbit Antibody [P2F10] 用于检测内源性 p130 Cas 总的蛋白水平。基于序列同源性，该抗体不与其他SMC蛋白（包括SMC1、SMC2和SMC3）发生交叉反应。但仍可在约48 kDa处检测到一条未知来源的条带。

背景

p130Cas（也称为BCAR1）是一种多结构域支架蛋白和Src底物，在焦点粘附（FAs）中的整合素介导信号传导中起着核心作用，在其中调节细胞粘附、迁移、增殖、生存和肿瘤进展。它在哺乳动物细胞中普遍表达，尤其是在参与粘附和迁移的细胞中，并在多种癌症中（如乳腺癌）上调并超磷酸化，促进他莫昔芬耐药性。从结构上看，p130Cas包含一个N末端SH3结构域，可结合FAK等蛋白中的富含脯氨酸的基序，一个富含脯氨酸的区域（PRR），一个大的底物结构域（SD），含有15个YxxP基序， Src家族激酶磷酸化后招募SH2含量蛋白如Crk，一个富含丝氨酸的区域，以及一个C末端的Cas家族同源结构域（CCHD），可与paxillin LD1基序结合，结构上模仿FAK焦点粘附靶向结构域。SH3结构域和CCHD都对于将p130Cas靶向到焦点粘附至关重要，在那里它的磷酸化启动下游信号级联反应，这些反应对于细胞骨架重塑和致癌过程至关重要。

使用信息

抗体应用

WB, IP, IHC, IF, FCM

稀释比例

WB	IP	IHC	IF	FCM
1:1000	1:100	1:50 - 1:200	1:100 - 1:400	1:100 - 1:400

反应性

Human, Mouse, Rat, Monkey

抗体类型

Rabbit

MW

130 kDa

储存液配方

PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3

储存条件
(自收到货起)

-20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years

实验方法
WB	实验步骤：样品制备 1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 将细胞转移至EP管中。用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声破碎，冰上静置裂解 30 min。冰上静置裂解 5 min。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液； 5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度； 6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。电泳分离 1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：5 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）转膜 1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中； 2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗； 3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表湿转法参考条件：200 mA, 120 min。（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）封闭 1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min； 2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温； 3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。抗体孵育 1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min； 3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h； 4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。显色 1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀； 2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。(建议曝光时长 60s 以上)。

实验方法

WB

实验步骤：

样品制备

1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。

2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 将细胞转移至EP管中。用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声破碎，冰上静置裂解 30 min。冰上静置裂解 5 min。

3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。

4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；

5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；

6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。

电泳分离

1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：5 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表

2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）

转膜

1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；

2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；

3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；

4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表

湿转法参考条件：200 mA, 120 min。

（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）

封闭

1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；

2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；

3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

抗体孵育

1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；

2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；

3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；

4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

显色

1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；

2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。(建议曝光时长 60s 以上)。

文献参考

[1] Zhang C, et al. J Biol Chem. 2017 Nov 3;292(44):18281-18289.

Application Data

WB

Validated by Selleck

Lane 1: HepG2, Lane 2: NIH/3T3, Lane 3: PC-12