Anti-Phospho-CDK2 (Thr160) Rabbit Antibody [N24F24] Datasheet

生物描述

特异性	Anti-Phospho-CDK2 (Thr160) Rabbit Antibody [N24F24] 用于检测当 Thr 160位点磷酸化时内源性 Phospho-CDK2 (Thr 160) 总的蛋白水平。
背景	CDK2（细胞周期蛋白依赖性激酶2）在丝氨酸160位点的磷酸化是其完全激活的关键步骤，使其能够调节细胞周期的进程。Thr160位于CDK2的激活环（AL）中，磷酸化后稳定了激活环，减少其柔性，使底物能够有效地与其结合。此磷酸化通常由CDK激活激酶（CAK）介导，CAK将磷酸基从ATP转移到Thr160。该磷酸化促使与底物上P+3位点的赖氨酸残基形成离子相互作用，促进底物识别并增强CDK2的催化效率。CDK2与细胞周期蛋白（如细胞周期蛋白A和细胞周期蛋白E）形成复合物，Thr160的磷酸化显著提高了其在这些复合物中的酶活性。该酶在活性位点中帮助镁离子（Mg²⁺）催化磷酸转移反应，并在催化过程中稳定过渡态。Thr160的去磷酸化由磷酸酶（如KAP）介导，除非与细胞周期蛋白结合，否则会抑制CDK2的活性，从而确保其适当的调节。CDK2还可以在特定条件下自磷酸化Thr160，进一步调节其激活。这一磷酸化事件在细胞周期中受到严格调控，在S期和G2期达到高峰，以确保细胞周期的顺利进展。Thr160磷酸化的失调会破坏底物识别和酶活性，从而妨碍细胞周期的正常调控。

特异性

Anti-Phospho-CDK2 (Thr160) Rabbit Antibody [N24F24] 用于检测当 Thr 160位点磷酸化时内源性 Phospho-CDK2 (Thr 160) 总的蛋白水平。

背景

CDK2（细胞周期蛋白依赖性激酶2）在丝氨酸160位点的磷酸化是其完全激活的关键步骤，使其能够调节细胞周期的进程。Thr160位于CDK2的激活环（AL）中，磷酸化后稳定了激活环，减少其柔性，使底物能够有效地与其结合。此磷酸化通常由CDK激活激酶（CAK）介导，CAK将磷酸基从ATP转移到Thr160。该磷酸化促使与底物上P+3位点的赖氨酸残基形成离子相互作用，促进底物识别并增强CDK2的催化效率。CDK2与细胞周期蛋白（如细胞周期蛋白A和细胞周期蛋白E）形成复合物，Thr160的磷酸化显著提高了其在这些复合物中的酶活性。该酶在活性位点中帮助镁离子（Mg²⁺）催化磷酸转移反应，并在催化过程中稳定过渡态。Thr160的去磷酸化由磷酸酶（如KAP）介导，除非与细胞周期蛋白结合，否则会抑制CDK2的活性，从而确保其适当的调节。CDK2还可以在特定条件下自磷酸化Thr160，进一步调节其激活。这一磷酸化事件在细胞周期中受到严格调控，在S期和G2期达到高峰，以确保细胞周期的顺利进展。Thr160磷酸化的失调会破坏底物识别和酶活性，从而妨碍细胞周期的正常调控。

使用信息

抗体应用

WB, IHC, IF, ELISA

稀释比例

WB	IHC	IF
1:2000-1:6000	1:50 - 1:200	1:50 - 1:200

反应性

Human, Mouse, Rat

抗体类型

Rabbit

MW

34kDa

储存液配方

PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3

储存条件
(自收到货起)

-20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years

实验方法
WB	实验步骤：样品制备 1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 将细胞转移至EP管中。用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声破碎，冰上静置裂解 30 min。冰上静置裂解 5 min。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液； 5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度； 6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。电泳分离 1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）转膜 1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中； 2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗； 3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表湿转法参考条件：200 mA, 120 min。（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）封闭 1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min； 2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温； 3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。抗体孵育 1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:2000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min； 3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h； 4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。显色 1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀； 2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

实验方法

WB

实验步骤：

样品制备

1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。

2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 将细胞转移至EP管中。用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声破碎，冰上静置裂解 30 min。冰上静置裂解 5 min。

3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。

4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；

5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；

6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。

电泳分离

1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表

2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）

转膜

1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；

2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；

3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；

4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表

湿转法参考条件：200 mA, 120 min。

（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）

封闭

1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；

2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；

3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

抗体孵育

1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:2000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；

2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；

3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；

4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

显色

1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；

2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

文献参考

Application Data

WB

Validated by Selleck

Lane 1: C6
Lane 2: C6 (Nocodazole, 50 ng/ml, 37℃,20 h)