Anti-Phospho-FRA1 (Ser265) Rabbit Antibody [N10P17] Datasheet

生物描述

特异性	Anti-Phospho-FRA1 (Ser265) Rabbit Antibody [N10P17] 仅当丝氨酸265位点( Ser265 )磷酸化时才可识别内源性 FRA1 蛋白。
背景	Fos 相关抗原 1 (Fos-related antigen 1, Fra-1)是激活蛋白 1 (AP-1) 转录因子家族的成员，在调控细胞增殖、凋亡、分化、炎症、致癌和肿瘤转移等方面具有关键作用。Fra-1 由 FOSL1 基因编码，属于 AP-1 复合物中的 FOS 家族，该复合物还包括 c-Fos、FosB、Fos 相关抗原 2 (Fra-2) 以及 FosB 的两种同工型：全长 FosB 和较短的 ΔFosB（缺少 C- 末端 101 个氨基酸）。Fos 的蛋白表达受各种细胞外信号（如生长因子、细胞因子、神经递质、激素和应激）迅速而短暂的诱导。Erk 激酶响应这些信号对 Fos 蛋白进行磷酸化，从而增强其转录活性。具体而言，Erk1/2 对 Ser252 和 Ser265 位点 Fra-1 的磷酸化可稳定该蛋白，导致其在癌细胞中过度表达。在癌症中， Fra-1 水平升高常伴随着 Erk1/2 的高活性，这一情况与肿瘤发生密切相关。

特异性

Anti-Phospho-FRA1 (Ser265) Rabbit Antibody [N10P17] 仅当丝氨酸265位点( Ser265 )磷酸化时才可识别内源性 FRA1 蛋白。

背景

Fos 相关抗原 1 (Fos-related antigen 1, Fra-1)是激活蛋白 1 (AP-1) 转录因子家族的成员，在调控细胞增殖、凋亡、分化、炎症、致癌和肿瘤转移等方面具有关键作用。Fra-1 由 FOSL1 基因编码，属于 AP-1 复合物中的 FOS 家族，该复合物还包括 c-Fos、FosB、Fos 相关抗原 2 (Fra-2) 以及 FosB 的两种同工型：全长 FosB 和较短的 ΔFosB（缺少 C- 末端 101 个氨基酸）。Fos 的蛋白表达受各种细胞外信号（如生长因子、细胞因子、神经递质、激素和应激）迅速而短暂的诱导。Erk 激酶响应这些信号对 Fos 蛋白进行磷酸化，从而增强其转录活性。具体而言，Erk1/2 对 Ser252 和 Ser265 位点 Fra-1 的磷酸化可稳定该蛋白，导致其在癌细胞中过度表达。在癌症中， Fra-1 水平升高常伴随着 Erk1/2 的高活性，这一情况与肿瘤发生密切相关。

使用信息

抗体应用

WB, ChIP

稀释比例

WB	CHIP
1:1000	1:50

反应性

Human, Mouse, Rat, Monkey, Bovine, Horse

抗体类型

Rabbit

MW

40 kda

储存液配方

PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN₃

储存条件
(自收到货起)

–20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years

实验方法
WB	实验步骤：样品制备 1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/Nuclear Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 将细胞转移至EP管中。用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/Nuclear Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），超声破碎，冰上静置裂解 30 min。冰上静置裂解 5 min。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/Nuclear Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液； 5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度； 6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。电泳分离 1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）转膜 1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中； 2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗； 3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表湿转法参考条件：200 mA, 60 min。（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）封闭 1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min； 2. 在封闭液（建议使用 5% BSA溶液）中将膜孵育 1 h，室温； 3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。抗体孵育 1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min； 3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h； 4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。显色 1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀； 2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

实验方法

WB

实验步骤：

样品制备

1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/Nuclear Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。

2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 将细胞转移至EP管中。用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/Nuclear Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），超声破碎，冰上静置裂解 30 min。冰上静置裂解 5 min。

3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/Nuclear Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。

4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；

5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；

6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。

电泳分离

1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表

2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）

转膜

1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；

2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；

3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；

4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表

湿转法参考条件：200 mA, 60 min。

（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）

封闭

1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；

2. 在封闭液（建议使用 5% BSA溶液）中将膜孵育 1 h，室温；

3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

抗体孵育

1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；

2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；

3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；

4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

显色

1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；

2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

文献参考

[1] He YY, et al. Front Immunol. 2022 Aug 11:13:954744.

Application Data

WB

Validated by Selleck

Lane 1: HeLa (serum-starved)
Lane 2: HeLa (serum-starved; TPA-treated, 4h)
Lane 3: HeLa (serum-starved; TPA-treated, 4h; λ phosphatase treated)