Anti-Phospho-Hsp27 (Ser82) Rabbit Antibody [M1P19] Datasheet

生物描述

特异性	Anti-Phospho-Hsp27 (Ser82) Rabbit Antibody [M1P19] 仅识别 Ser82 处磷酸化的内源性 HSP27 蛋白水平。
背景	热休克蛋白27 (HSP27) 是小分子热休克蛋白 (sHSP) 家族 (12-43 kDa) 的成员，具有广泛的细胞功能。它作为分子伴侣、抗氧化剂、细胞凋亡调节剂以及肌动蛋白细胞骨架重塑的介质发挥作用。与其他小分子 HSP 一样，HSP27 在其 C 末端区域包含一个保守的 α-晶体蛋白结构域。在氧化应激下，HSP27 通过降低胞内活性氧 (ROS) 水平来保护细胞，这可通过增强谷胱甘肽生成和降低游离铁的利用来实现。它还具有强大的抗凋亡活性，可影响线粒体依赖性和非线粒体依赖性的凋亡途径。例如，在 Fas–FasL 介导的细胞凋亡过程中，HSP27 与 DAXX 结合，阻止 DAXX 与 ASK1 结合。此外，它与Bax和细胞色素c相互作用，从而抑制线粒体凋亡并阻断caspase依赖性细胞死亡。HSP27在大多数细胞和组织中以基础水平表达，通常以大型寡聚复合物的形式存在。当细胞受到应激时，其表达显著升高，增强细胞对损伤环境的抵抗力。该蛋白质在人类中Ser15、Ser78和Ser82位点（啮齿动物中Ser15和Ser86位点）发生应激诱导的磷酸化，由p38 MAPK信号通路下游的MAPKAP激酶2/3介导。磷酸化不仅影响其寡聚状态，还调节其与伴侣蛋白的相互作用。在中性粒细胞中，HSP27与AKT和MAPKAP激酶2形成复合物，从而抑制组成性凋亡并促进炎症反应。应激诱导的HSP27磷酸化会破坏该复合物，导致其与AKT解离，并恢复中性粒细胞凋亡。值得注意的是，HSP27磷酸化的作用高度依赖于环境，会因细胞类型和信号传导环境而异。

特异性

Anti-Phospho-Hsp27 (Ser82) Rabbit Antibody [M1P19] 仅识别 Ser82 处磷酸化的内源性 HSP27 蛋白水平。

背景

热休克蛋白27 (HSP27) 是小分子热休克蛋白 (sHSP) 家族 (12-43 kDa) 的成员，具有广泛的细胞功能。它作为分子伴侣、抗氧化剂、细胞凋亡调节剂以及肌动蛋白细胞骨架重塑的介质发挥作用。与其他小分子 HSP 一样，HSP27 在其 C 末端区域包含一个保守的 α-晶体蛋白结构域。在氧化应激下，HSP27 通过降低胞内活性氧 (ROS) 水平来保护细胞，这可通过增强谷胱甘肽生成和降低游离铁的利用来实现。它还具有强大的抗凋亡活性，可影响线粒体依赖性和非线粒体依赖性的凋亡途径。例如，在 Fas–FasL 介导的细胞凋亡过程中，HSP27 与 DAXX 结合，阻止 DAXX 与 ASK1 结合。此外，它与Bax和细胞色素c相互作用，从而抑制线粒体凋亡并阻断caspase依赖性细胞死亡。HSP27在大多数细胞和组织中以基础水平表达，通常以大型寡聚复合物的形式存在。当细胞受到应激时，其表达显著升高，增强细胞对损伤环境的抵抗力。该蛋白质在人类中Ser15、Ser78和Ser82位点（啮齿动物中Ser15和Ser86位点）发生应激诱导的磷酸化，由p38 MAPK信号通路下游的MAPKAP激酶2/3介导。磷酸化不仅影响其寡聚状态，还调节其与伴侣蛋白的相互作用。在中性粒细胞中，HSP27与AKT和MAPKAP激酶2形成复合物，从而抑制组成性凋亡并促进炎症反应。应激诱导的HSP27磷酸化会破坏该复合物，导致其与AKT解离，并恢复中性粒细胞凋亡。值得注意的是，HSP27磷酸化的作用高度依赖于环境，会因细胞类型和信号传导环境而异。

使用信息

抗体应用

WB, IP

稀释比例

WB	IP
1:1000 - 1:2000	1:75

反应性

Mouse, Rat, Human

抗体类型

Rabbit

MW

23 kDa

储存液配方

PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3

储存条件
(自收到货起)

-20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years

实验方法
WB	实验步骤：样品制备 1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），低温匀浆。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液； 5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度； 6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。电泳分离 1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）转膜 1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中； 2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗； 3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表湿转法参考条件：200 mA, 60 min。（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）封闭 1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min； 2. 在封闭液（建议使用 5% BSA溶液）中将膜孵育 1 h，室温； 3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。抗体孵育 1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min； 3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h； 4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。显色 1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀； 2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

实验方法

WB

实验步骤：

样品制备

1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），低温匀浆。

2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。

3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。

4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；

5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；

6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。

电泳分离

1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表

2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）

转膜

1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；

2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；

3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；

4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表

湿转法参考条件：200 mA, 60 min。

（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）

封闭

1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；

2. 在封闭液（建议使用 5% BSA溶液）中将膜孵育 1 h，室温；

3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

抗体孵育

1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；

2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；

3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；

4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

显色

1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；

2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

文献参考

[1] Vidyasagar A, et al. Fibrogenesis Tissue Repair. 2012 May 7;5(1):7.

Anti-Phospho-Hsp27 (Ser82) Rabbit Antibody [M1P19]

生物描述

使用信息

文献参考

Application Data