Anti-Phospho-IGF-1R β (Y1131)/IR β (Y1146) Rabbit Antibody [J6K20] Datasheet

生物描述

特异性	Anti-Phospho-IGF-1R β (Y1131)/IR β (Y1146) Rabbit Antibody [J6K20] 仅识别 Tyr1131 处磷酸化的内源性 IGF-I Receptor β 蛋白水平和 Tyr1146 处磷酸化的 insulin receptor β 蛋白水平。抗体与活化的 ErbB2 和 ALK 存在交叉反应。
背景	血管胰岛素样生长因子-1 (IGF-1) 系统由IGF、IGF-1受体 (IGF-1R) 和一系列IGF结合蛋白组成。该生长因子网络通过内分泌和自分泌/旁分泌途径发挥作用，影响多种血管功能。尽管IGF-1活性主要由IGF-1R介导，但其活性也受IGF结合蛋白的精细调控，这些蛋白的功能通过磷酸化、蛋白酶解、聚合以及与细胞或细胞外基质的结合来调节。IGF系统成分的表达受多种刺激因素控制，包括其他生长因子、细胞因子、脂蛋白、活性氧和血流动力学因素。此外，已观察到IGF系统与各种生长因子通路以及整合素受体之间存在交叉通讯。在人类中，IGF-1R由位于15号染色体上的单拷贝基因编码，并广泛表达。成熟受体为四聚体，由两条胞外α链和两条胞内β链组成。β链含有胞内酪氨酸激酶结构域，该结构域对大多数受体介导的生物学功能至关重要。IGF-1结合后，IGF-1R发生自身磷酸化，随后Shc等衔接蛋白和胰岛素受体底物（IRS-1、IRS-2、IRS-3和IRS-4）发生酪氨酸磷酸化。IRS蛋白作为对接平台，触发多个下游信号级联，特别是磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）、Akt和丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路。这些信号事件导致不同的细胞反应，包括增殖、分化、迁移和存活。 IGF-1R激酶结构域内的初始自身磷酸化发生在三个关键酪氨酸残基上——Tyr1131、Tyr1135和Tyr1136。胰岛素受体(IR)的结构和功能与IGF-1R高度相似，在其激酶结构域的活化环内也拥有类似的酪氨酸簇——Tyr1146、Tyr1150和Tyr1151。

特异性

Anti-Phospho-IGF-1R β (Y1131)/IR β (Y1146) Rabbit Antibody [J6K20] 仅识别 Tyr1131 处磷酸化的内源性 IGF-I Receptor β 蛋白水平和 Tyr1146 处磷酸化的 insulin receptor β 蛋白水平。抗体与活化的 ErbB2 和 ALK 存在交叉反应。

背景

血管胰岛素样生长因子-1 (IGF-1) 系统由IGF、IGF-1受体 (IGF-1R) 和一系列IGF结合蛋白组成。该生长因子网络通过内分泌和自分泌/旁分泌途径发挥作用，影响多种血管功能。尽管IGF-1活性主要由IGF-1R介导，但其活性也受IGF结合蛋白的精细调控，这些蛋白的功能通过磷酸化、蛋白酶解、聚合以及与细胞或细胞外基质的结合来调节。IGF系统成分的表达受多种刺激因素控制，包括其他生长因子、细胞因子、脂蛋白、活性氧和血流动力学因素。此外，已观察到IGF系统与各种生长因子通路以及整合素受体之间存在交叉通讯。在人类中，IGF-1R由位于15号染色体上的单拷贝基因编码，并广泛表达。成熟受体为四聚体，由两条胞外α链和两条胞内β链组成。β链含有胞内酪氨酸激酶结构域，该结构域对大多数受体介导的生物学功能至关重要。IGF-1结合后，IGF-1R发生自身磷酸化，随后Shc等衔接蛋白和胰岛素受体底物（IRS-1、IRS-2、IRS-3和IRS-4）发生酪氨酸磷酸化。IRS蛋白作为对接平台，触发多个下游信号级联，特别是磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）、Akt和丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路。这些信号事件导致不同的细胞反应，包括增殖、分化、迁移和存活。 IGF-1R激酶结构域内的初始自身磷酸化发生在三个关键酪氨酸残基上——Tyr1131、Tyr1135和Tyr1136。胰岛素受体(IR)的结构和功能与IGF-1R高度相似，在其激酶结构域的活化环内也拥有类似的酪氨酸簇——Tyr1146、Tyr1150和Tyr1151。

使用信息

抗体应用

WB, IP

稀释比例

WB	IP
1:1000	1:100

反应性

Human

抗体类型

Rabbit

MW

95 kDa

储存液配方

PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3

储存条件
(自收到货起)

-20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years

实验方法
WB	实验步骤：样品制备 1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），低温匀浆。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液； 5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度； 6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。电泳分离 1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）转膜 1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中； 2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗； 3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表湿转法参考条件：200 mA, 120 min。（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）封闭 1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min； 2. 在封闭液（建议使用 5% BSA溶液）中将膜孵育 1 h，室温； 3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。抗体孵育 1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min； 3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h； 4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。显色 1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀； 2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

实验方法

WB

实验步骤：

样品制备

1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），低温匀浆。

2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。

3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。

4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；

5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；

6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。

电泳分离

1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表

2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）

转膜

1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；

2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；

3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；

4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表

湿转法参考条件：200 mA, 120 min。

（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）

封闭

1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；

2. 在封闭液（建议使用 5% BSA溶液）中将膜孵育 1 h，室温；

3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

抗体孵育

1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；

2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；

3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；

4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

显色

1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；

2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

Anti-Phospho-IGF-1R β (Y1131)/IR β (Y1146) Rabbit Antibody [J6K20]

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