Anti-Phospho-IκBα (Ser32/36) Mouse Antibody [F24N7] Datasheet

生物描述

特异性	Anti-Phospho-IκBα (Ser32/36) Mouse Antibody [F24N7] 仅识别 Ser32/36 处磷酸化的内源性 IκBα 总蛋白水平。
背景	IκB激酶 (IKK) 复合物是激活 NF-κB 通路的中枢信号转导枢纽。该复合物由两个催化亚基 IKKα 和 IKKβ（丝氨酸/苏氨酸激酶）以及一个调节亚基 NEMO（NF-κB 必需调节剂，也称为 IKKγ）组成。IKK 复合物整合了多种激活 NF-κB 的上游信号，导致 IκB 蛋白、NF-κB 亚基和其他细胞靶标发生磷酸化。在未受刺激的细胞中，NF-κB 转录因子通过与抑制性 IκB 蛋白（例如 IκBα、IκBβ 和 IκBε）或前体蛋白 p100 和 p105 结合，在细胞质中维持非活性状态。这些抑制性蛋白阻止 NF-κB 进入细胞核并启动基因转录。受到刺激后，IκB 蛋白会在特定丝氨酸残基（尤其是 IκBα 的 Ser32 和 Ser36 位点）上被激活的 IKK 复合物磷酸化。这种磷酸化标记 IκB，使其能够被 SCFβTrCP E3 泛素连接酶复合物识别，从而导致其泛素化并随后通过蛋白酶体降解。IκB 降解会释放 NF-κB 二聚体，这些二聚体随后转位至细胞核，驱动靶基因的转录。多种外界信号，包括炎症细胞因子、生长因子和趋化因子，均可触发这一级联反应，最终导致 IκBα 磷酸化并激活 NF-κB 依赖性基因表达。

特异性

Anti-Phospho-IκBα (Ser32/36) Mouse Antibody [F24N7] 仅识别 Ser32/36 处磷酸化的内源性 IκBα 总蛋白水平。

背景

IκB激酶 (IKK) 复合物是激活 NF-κB 通路的中枢信号转导枢纽。该复合物由两个催化亚基 IKKα 和 IKKβ（丝氨酸/苏氨酸激酶）以及一个调节亚基 NEMO（NF-κB 必需调节剂，也称为 IKKγ）组成。IKK 复合物整合了多种激活 NF-κB 的上游信号，导致 IκB 蛋白、NF-κB 亚基和其他细胞靶标发生磷酸化。在未受刺激的细胞中，NF-κB 转录因子通过与抑制性 IκB 蛋白（例如 IκBα、IκBβ 和 IκBε）或前体蛋白 p100 和 p105 结合，在细胞质中维持非活性状态。这些抑制性蛋白阻止 NF-κB 进入细胞核并启动基因转录。受到刺激后，IκB 蛋白会在特定丝氨酸残基（尤其是 IκBα 的 Ser32 和 Ser36 位点）上被激活的 IKK 复合物磷酸化。这种磷酸化标记 IκB，使其能够被 SCFβTrCP E3 泛素连接酶复合物识别，从而导致其泛素化并随后通过蛋白酶体降解。IκB 降解会释放 NF-κB 二聚体，这些二聚体随后转位至细胞核，驱动靶基因的转录。多种外界信号，包括炎症细胞因子、生长因子和趋化因子，均可触发这一级联反应，最终导致 IκBα 磷酸化并激活 NF-κB 依赖性基因表达。

使用信息

抗体应用

WB

稀释比例

WB

1:1000

反应性

Human, Mouse, Rat, Monkey

抗体类型

Mouse

MW

40 kDa

储存液配方

PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3

储存条件
(自收到货起)

-20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years

实验方法
WB	实验步骤：样品制备 1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/Nuclear Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），低温匀浆。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/Nuclear Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/Nuclear Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液； 5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度； 6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。电泳分离 1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）转膜 1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中； 2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗； 3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表湿转法参考条件：200 mA, 60 min。（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）封闭 1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min； 2. 在封闭液（建议使用 5% BSA溶液）中将膜孵育 1 h，室温； 3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。抗体孵育 1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min； 3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h； 4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。显色 1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀； 2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。 (建议曝光时长 150s 以上)

实验方法

WB

实验步骤：

样品制备

1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/Nuclear Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），低温匀浆。

2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/Nuclear Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。

3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/Nuclear Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。

4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；

5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；

6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。

电泳分离

1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表

2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）

转膜

1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；

2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；

3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；

4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表

湿转法参考条件：200 mA, 60 min。

（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）

封闭

1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；

2. 在封闭液（建议使用 5% BSA溶液）中将膜孵育 1 h，室温；

3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

抗体孵育

1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；

2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；

3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；

4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

显色

1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；

2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。 (建议曝光时长 150s 以上)

Anti-Phospho-IκBα (Ser32/36) Mouse Antibody [F24N7]

生物描述

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