Anti-Phospho-IKB α (Ser36) Rabbit Antibody [B13N13] Datasheet

生物描述

特异性	Anti-Phospho-IKB α (Ser36) Rabbit Antibody [B13N13] 可检测当 Ser 36 位点磷酸化时内源性 IKBα 总的蛋白水平。
背景	核因子 κB (NF-κB) 是 NF-κB/Rel 蛋白家族中一个关键的转录调控因子家族，存在于几乎所有细胞类型中。其活性受到抑制蛋白 IκB 的严格控制，该抑制蛋白与 NF-κB 二聚体（同源或异源）结合，形成三聚体复合物，使 NF-κB 在细胞质中被隔离和失活。IκBα 是 IκB 家族中最普遍的成员，具有在细胞质和细胞核之间穿梭的能力，导致动态的细胞内分布。人类 IκBα 蛋白由 317 个氨基酸组成，分子量为 36 kDa。在其游离形式下，IκBα 呈现熔球结构。其 N 端信号响应结构域 (SRD) 在接收磷酸化、泛素化和 SUMO 化信号中起着至关重要的作用。该结构域包含 Ser32、Ser36 和 Tyr42 处的磷酸化位点、Lys21 和 Lys22 处的泛素化位点以及 Lys21 和 Lys38 处的 SUMO 化位点。SRD 对激活 NF-κB 至关重要。IκB 激酶 (IKK) 复合物可由脂多糖 (LPS)、病毒蛋白、活性氧、细胞因子和其他刺激物触发，磷酸化 IκBα 的 SRD 区域中的 Ser32 和 Ser36。这种磷酸化导致 IκBα 泛素化并随后被蛋白酶体降解，从而释放 NF-κB 进入细胞核并激活靶基因。 IκBα 突变导致 Ser32/Ser36 获得功能变化，可导致伴有免疫缺陷的常染色体显性无汗性外胚层发育不良。

特异性

Anti-Phospho-IKB α (Ser36) Rabbit Antibody [B13N13] 可检测当 Ser 36 位点磷酸化时内源性 IKBα 总的蛋白水平。

背景

核因子 κB (NF-κB) 是 NF-κB/Rel 蛋白家族中一个关键的转录调控因子家族，存在于几乎所有细胞类型中。其活性受到抑制蛋白 IκB 的严格控制，该抑制蛋白与 NF-κB 二聚体（同源或异源）结合，形成三聚体复合物，使 NF-κB 在细胞质中被隔离和失活。IκBα 是 IκB 家族中最普遍的成员，具有在细胞质和细胞核之间穿梭的能力，导致动态的细胞内分布。人类 IκBα 蛋白由 317 个氨基酸组成，分子量为 36 kDa。在其游离形式下，IκBα 呈现熔球结构。其 N 端信号响应结构域 (SRD) 在接收磷酸化、泛素化和 SUMO 化信号中起着至关重要的作用。该结构域包含 Ser32、Ser36 和 Tyr42 处的磷酸化位点、Lys21 和 Lys22 处的泛素化位点以及 Lys21 和 Lys38 处的 SUMO 化位点。SRD 对激活 NF-κB 至关重要。IκB 激酶 (IKK) 复合物可由脂多糖 (LPS)、病毒蛋白、活性氧、细胞因子和其他刺激物触发，磷酸化 IκBα 的 SRD 区域中的 Ser32 和 Ser36。这种磷酸化导致 IκBα 泛素化并随后被蛋白酶体降解，从而释放 NF-κB 进入细胞核并激活靶基因。 IκBα 突变导致 Ser32/Ser36 获得功能变化，可导致伴有免疫缺陷的常染色体显性无汗性外胚层发育不良。

使用信息

抗体应用

WB, FCM

稀释比例

WB	FCM
1:10000	1:100

反应性

Human, Mouse, Rat

抗体类型

Rabbit

MW

35-40 kDa

储存液配方

PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN₃

储存条件
(自收到货起)

-20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years

实验方法
WB	实验步骤：样品制备 1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 将细胞转移至EP管中。用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），超声破碎，冰上静置裂解 30 min。冰上静置裂解 5 min。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液； 5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度； 6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。电泳分离 1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）转膜 1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中； 2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗； 3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表湿转法参考条件：200 mA, 60 min。（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）封闭 1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min； 2. 在封闭液（建议使用 5% BSA溶液）中将膜孵育 1 h，室温； 3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。抗体孵育 1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:10000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min； 3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h； 4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。显色 1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀； 2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

实验方法

WB

实验步骤：

样品制备

1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。

2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 将细胞转移至EP管中。用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），超声破碎，冰上静置裂解 30 min。冰上静置裂解 5 min。

3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。

4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；

5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；

6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。

电泳分离

1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表

2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）

转膜

1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；

2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；

3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；

4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表

湿转法参考条件：200 mA, 60 min。

（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）

封闭

1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；

2. 在封闭液（建议使用 5% BSA溶液）中将膜孵育 1 h，室温；

3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

抗体孵育

1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:10000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；

2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；

3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；

4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

显色

1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；

2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

文献参考

[1] Wang X, et al. Front Cell Dev Biol. 2020 Nov 5;8:574706.

Application Data

WB

Validated by Selleck

Lane 1: C6
Lane 2: C6 (Calyculin A, 100ng/ml ,60 min)
Lane 3: C6 (Calyculin A, 100ng/ml ,60 min; Alkaline phosphatase-treated)