Anti-Phospho-IRS-1 (Ser318) Rabbit Antibody [C11A11]

目录号：F1370

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生物描述

特异性

Anti-Phospho-IRS-1 (Ser318) Rabbit Antibody [C11A11] 仅识别 Ser318 处磷酸化的内源性 IRS-1 总蛋白水平。
背景 磷酸化IRS-1 (Ser318) 是指在丝氨酸残基 318 位点磷酸化的胰岛素受体底物-1 蛋白（啮齿动物为 Ser318 位点；人类为 Ser323 位点），该调控位点位于磷酸酪氨酸结合 (PTB) 结构域和 C 端效应子对接区之间。在骨骼肌细胞和组织中，该位点在胰岛素刺激后会快速磷酸化，但在诱导胰岛素抵抗的刺激（例如 TNF-α 或高血糖）刺激下则不会发生磷酸化。从结构上讲，IRS-1 是一个在胰岛素信号转导中发挥关键作用的多结构域衔接蛋白，而由非典型 PKC-ζ 介导的 Ser318 位点磷酸化起着双重调控作用。最初，它通过促进 Akt/PKB Ser473 磷酸化和葡萄糖摄取来增强胰岛素信号转导，但它对于随后胰岛素作用的延长也起着至关重要的作用。突变研究表明，非磷酸化（Ala318）或磷酸化模拟（Glu318）变体会显著改变胰岛素反应，突出表明磷酸化 Ser318 是维持胰岛素信号刺激和/或衰减之间平衡的关键调节剂，特别是在葡萄糖吸收速率受限制的骨骼肌中。

使用信息

抗体应用 WB, IP 稀释比例
WB IP
1:1000 1:50
反应性 Human, Mouse
抗体类型 Rabbit MW 180 kDa
储存液配方 PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3
储存条件
(自收到货起)		 -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years
WB
实验步骤：
 
样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），低温匀浆。
2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。
3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。
4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
 
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：5 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表
2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
 
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；
4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表
湿转法参考条件：200 mA, 120 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
 
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液（建议使用 5% BSA溶液）中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
 
抗体孵育
1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；
2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
 
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。(建议曝光时长 60s 以上)。
 

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