Anti-Phospho-Met (Tyr1003) Rabbit Antibody [A3E17]

目录号：F1377

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生物描述

特异性

Anti-Phospho-Met (Tyr1003) Rabbit Antibody [A3E17] 仅识别 Tyr1003 处磷酸化的内源性 Met 总蛋白水平。
背景 磷酸化MET (Tyr1003) 是指在酪氨酸残基1003处被磷酸化的肝细胞生长因子受体 (MET)，该位点是受体近膜结构域内的关键调控位点。MET是由位于染色体7q21-31的MET基因编码的IV类受体酪氨酸激酶，主要在上皮细胞表面表达。从结构上讲，MET是一个单次跨膜蛋白，由胞外结构域（SEMA、PSI和四个IPT结构域）、跨膜螺旋和胞内部分组成，胞内部分包括近膜(JM)结构域、酪氨酸激酶(TK)结构域和羧基末端尾。 MET与其配体肝细胞生长因子 (HGF) 结合后发生二聚化，导致TK和COOH末端区域内特定酪氨酸残基发生自身磷酸化，从而启动下游信号转导，促进细胞增殖、存活、迁移和形态形成。MET主要在上皮细胞中表达，并在多种癌症中上调。Tyr1003的磷酸化对于E3泛素连接酶CBL通过其SH2样TKB结构域的结合至关重要。这种相互作用促进MET受体的泛素化、内化和溶酶体降解，作为终止信号转导的重要负反馈机制。Tyr1003的缺失或突变会阻止CBL结合，导致MET降解受损、受体活性延长和致癌转化，并且与肿瘤进展和MET靶向治疗的耐药性有关。

使用信息

抗体应用 WB 稀释比例
WB
1:1000
反应性 Human, Mouse, Rat
抗体类型 Rabbit MW 145 kDa
储存液配方 PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3
储存条件
(自收到货起)		 -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years
WB
实验步骤：
 
样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），低温匀浆。
2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。
3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。
4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
 
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：5 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表
2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
 
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；
4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表
湿转法参考条件：200 mA, 120 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
 
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液（建议使用 5% BSA溶液）中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
 
抗体孵育
1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；
2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
 
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
 

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