Anti-Phospho-p53 (Ser20) Rabbit Antibody [J22P21]

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生物描述

特异性

Anti-Phospho-p53 (Ser20) Rabbit Antibody [J22P21] 仅识别 Ser20 处磷酸化的内源性 p53 蛋白水平。
背景 p53是一种肿瘤抑制因子和应激激活转录因子，它通过将各种环境信号（例如DNA损伤、病毒感染、代谢应激和细胞因子信号）整合到协调的基因表达程序中来维持细胞完整性，从而调节DNA修复、细胞凋亡、代谢和细胞周期停滞。从结构上讲，人类p53是一个393个氨基酸的蛋白质，包含N末端转录激活结构域（TAD）、富含脯氨酸的结构域（PRD）、中心DNA结合结构域、四聚化结构域（TET）和C末端调控结构域（REG），并受到磷酸化、乙酰化、甲基化和泛素样修饰等翻译后修饰的广泛调控。它在大多数组织中以较低的基础水平表达，但在应激条件下会迅速稳定并被激活。在TAD的磷酸化位点中，Ser20高度保守，对于通过磷酸化SDLxxLL基序稳定p53-p300相互作用、促进DNA依赖性乙酰化以及p53靶基因的转录激活至关重要。Ser20磷酸化由不同的激酶以应激特异性的方式触发——ATM依赖性（电离辐射）、CK1（DNA病毒感染）、AMPK（代谢应激）和DAPK-1（致癌基因激活），并且对于有效的凋亡激活至关重要，尤其是在B细胞中。Ser20磷酸化失调会影响p53的抑癌功能，促进癌症发展，并影响衰老相关过程，凸显了其作为多条信号通路的交汇点和潜在治疗靶点的重要性。

使用信息

抗体应用 WB, IP 稀释比例
WB IP
1:1000-1:5000 1:10 - 1:100
反应性 Human
抗体类型 Rabbit MW 44 kDa
储存液配方 PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3
储存条件
(自收到货起)		 -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years
WB
实验步骤：
 
样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），低温匀浆。
2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。
3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。
4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
 
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表
2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
 
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；
4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表
湿转法参考条件：200 mA, 120 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
 
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液（建议使用 5% BSA溶液）中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
 
抗体孵育
1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；
2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
 
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。(建议曝光时长 60s 以上)。
 

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