Anti-Phospho-Src (Tyr529) Rabbit Antibody [D13P6] Datasheet

生物描述

特异性	Anti-Phospho-Src (Tyr529) Rabbit Antibody [D13P6] 用于检测当 Tyr 529 位点磷酸化时，内源性 Src 总的蛋白水平。该抗体可检测 Src 两种异构体的 Tyr 529 上的磷酸化水平。抗体免疫原与 Fyn 和 Yes 具有 93% 的同源性，与 Fgr 具有 85% 的同源性。因此，该抗体理论上有可能与这些蛋白质发生交叉反应。
背景	Src 是一种非受体型酪氨酸激酶，参与细胞生长、分化和存活等多种生物过程。其结构包括：N 端的肉豆蔻酰化位点（用于膜定位）；SH3 和 SH2 结构域（介导蛋白-蛋白相互作用）；酪氨酸激酶结构域（负责催化活性）；C 端调控区（包含 Tyr529）。C 端 Src 激酶（Csk）介导 Tyr529 的磷酸化，使其 SH2 结构域与该磷酸化位点相互作用，从而维持 Src 处于闭合、失活状态。这一调控机制确保了 Src 激酶活性在正常生理条件下受到严格控制。Src 活性失调（如突变或异常磷酸化）与癌症相关，在癌细胞中，Src 过度活化可促进细胞增殖和存活。因此，Tyr529 磷酸化状态的研究对于开发靶向 Src 活性的治疗策略至关重要。

特异性

Anti-Phospho-Src (Tyr529) Rabbit Antibody [D13P6] 用于检测当 Tyr 529 位点磷酸化时，内源性 Src 总的蛋白水平。该抗体可检测 Src 两种异构体的 Tyr 529 上的磷酸化水平。抗体免疫原与 Fyn 和 Yes 具有 93% 的同源性，与 Fgr 具有 85% 的同源性。因此，该抗体理论上有可能与这些蛋白质发生交叉反应。

背景

Src 是一种非受体型酪氨酸激酶，参与细胞生长、分化和存活等多种生物过程。其结构包括：N 端的肉豆蔻酰化位点（用于膜定位）；SH3 和 SH2 结构域（介导蛋白-蛋白相互作用）；酪氨酸激酶结构域（负责催化活性）；C 端调控区（包含 Tyr529）。C 端 Src 激酶（Csk）介导 Tyr529 的磷酸化，使其 SH2 结构域与该磷酸化位点相互作用，从而维持 Src 处于闭合、失活状态。这一调控机制确保了 Src 激酶活性在正常生理条件下受到严格控制。Src 活性失调（如突变或异常磷酸化）与癌症相关，在癌细胞中，Src 过度活化可促进细胞增殖和存活。因此，Tyr529 磷酸化状态的研究对于开发靶向 Src 活性的治疗策略至关重要。

使用信息

抗体应用

WB, IF

稀释比例

WB	IF
1:5000-1:10000	1:50-1:500

反应性

Human

抗体类型

Rabbit

MW

60 kDa

储存液配方

PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3

储存条件
(自收到货起)

-20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years

实验方法
IF
WB	实验步骤：样品制备 1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 将细胞转移至EP管中。用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声破碎，冰上静置裂解 30 min。冰上静置裂解 5 min。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液； 5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度； 6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。电泳分离 1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）转膜 1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中； 2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗； 3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表湿转法参考条件：200 mA, 120 min。（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）封闭 1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min； 2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温； 3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。抗体孵育 1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:5000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min； 3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h； 4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。显色 1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀； 2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。(建议曝光时长 60s 以上)。

文献参考

[1] Tang H, et al. J Biol Chem. 2005 Jun 24;280(25):23918-25.

Application Data

WB

Validated by Selleck

Lane 1: A431, Lane 2: A431 (EGF treated), Lane 3: A431 (EGF and alkaline phosphatase treated)