Anti-Phospho-STAT1 (Ser727) Rabbit Antibody [C14E15] Datasheet

生物描述

特异性	Anti-Phospho-STAT1 (Ser727) Rabbit Antibody [C14E15] 用于检测当 Ser 727 位点磷酸化时内源性 Phospho-STAT1 (Ser 727) 总的蛋白水平。
背景	磷酸化STAT1 (Ser727) 指的是STAT1蛋白在丝氨酸727位置的磷酸化，STAT1是一个关键的转录因子，参与细胞对应激因子（如紫外线辐射、LPS、TNF-α）和细胞因子信号（如IFN-γ）的反应。STAT1是信号转导与转录激活因子（STAT）家族的一员，包含一个N端结构域、DNA结合域、SH2结构域（用于二聚化）以及C端转激活结构域（TAD），Ser727位于此结构域内。由应激激活的激酶（如p38 MAPK、ERKs或PI-3K/Akt）介导的Ser727磷酸化，通过招募共激活因子（如CBP/p300）和染色质修饰因子增强转录活性，这与Tyr701磷酸化（经典的JAK依赖通路）不同。该修饰对于整合应激和免疫信号至关重要，能够增强巨噬细胞的抗微生物反应，并激活与凋亡、细胞存活和免疫记忆相关的基因。在紫外线B照射下，Ser727的磷酸化增加STAT1的DNA结合亲和力，推动应激反应基因网络的激活；而在IFN-γ信号传导中，它与Tyr701磷酸化协同作用，最大化靶基因的表达。刺激撤除后（如IFN-γ），持续的Ser727磷酸化可能通过与染色质相关的激酶（如CDK8）保持转录记忆。该过程的失调可通过调节肿瘤抑制基因和促炎介质（如iNOS）导致炎症、免疫逃逸及癌症发生。

特异性

Anti-Phospho-STAT1 (Ser727) Rabbit Antibody [C14E15] 用于检测当 Ser 727 位点磷酸化时内源性 Phospho-STAT1 (Ser 727) 总的蛋白水平。

背景

磷酸化STAT1 (Ser727) 指的是STAT1蛋白在丝氨酸727位置的磷酸化，STAT1是一个关键的转录因子，参与细胞对应激因子（如紫外线辐射、LPS、TNF-α）和细胞因子信号（如IFN-γ）的反应。STAT1是信号转导与转录激活因子（STAT）家族的一员，包含一个N端结构域、DNA结合域、SH2结构域（用于二聚化）以及C端转激活结构域（TAD），Ser727位于此结构域内。由应激激活的激酶（如p38 MAPK、ERKs或PI-3K/Akt）介导的Ser727磷酸化，通过招募共激活因子（如CBP/p300）和染色质修饰因子增强转录活性，这与Tyr701磷酸化（经典的JAK依赖通路）不同。该修饰对于整合应激和免疫信号至关重要，能够增强巨噬细胞的抗微生物反应，并激活与凋亡、细胞存活和免疫记忆相关的基因。在紫外线B照射下，Ser727的磷酸化增加STAT1的DNA结合亲和力，推动应激反应基因网络的激活；而在IFN-γ信号传导中，它与Tyr701磷酸化协同作用，最大化靶基因的表达。刺激撤除后（如IFN-γ），持续的Ser727磷酸化可能通过与染色质相关的激酶（如CDK8）保持转录记忆。该过程的失调可通过调节肿瘤抑制基因和促炎介质（如iNOS）导致炎症、免疫逃逸及癌症发生。

使用信息

抗体应用

WB, IHC

稀释比例

WB	IHC
1:1000-1:10000	1:100 - 1:250

反应性

Human, Mouse, Rat

抗体类型

Rabbit

MW

87 kDa

储存液配方

PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3

储存条件
(自收到货起)

-20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years

实验方法
WB	实验步骤：样品制备 1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 将细胞转移至EP管中。用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声破碎，冰上静置裂解 30 min。冰上静置裂解 5 min。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液； 5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度； 6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。电泳分离 1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）转膜 1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中； 2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗； 3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表湿转法参考条件：200 mA, 120 min。（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）封闭 1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min； 2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温； 3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。抗体孵育 1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:10000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min； 3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h； 4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。显色 1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀； 2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

实验方法

WB

实验步骤：

样品制备

1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。

2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 将细胞转移至EP管中。用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声破碎，冰上静置裂解 30 min。冰上静置裂解 5 min。

3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。

4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；

5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；

6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。

电泳分离

1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表

2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）

转膜

1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；

2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；

3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；

4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表

湿转法参考条件：200 mA, 120 min。

（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）

封闭

1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；

2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；

3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

抗体孵育

1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:10000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；

2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；

3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；

4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

显色

1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；

2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

文献参考

Application Data

WB

Validated by Selleck

Lane 1: HeLa, Lane 2: HeLa (Alkaline Phosphatase treated), Lane 3: Mouse brain, Lane 4: Rat brain