Anti-Phospho-TFEB (Ser211) Rabbit Antibody [N21G19]

目录号：F1474

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生物描述

特异性

Anti-Phospho-TFEB (Ser211) Rabbit Antibody [N21G19] 仅识别 Ser211 处磷酸化的内源性 TFEB 总蛋白水平。
背景 磷酸化TFEB (Ser211) 是指转录因子EB (TFEB) 在丝氨酸残基211处的磷酸化形式，该位点是其结构中的关键调控位点。TFEB是MiT/TFE家族中的一个碱性螺旋-环-螺旋-亮氨酸拉链 (bHLH-Zip) 转录因子，其调控与自噬、溶酶体生物合成和细胞清除相关的基因。全长TFEB蛋白包含DNA结合结构域、二聚化结构域和反式激活结构域，其中Ser211位于调节亚细胞定位的区域。其结构定义为：Gln谷氨酰胺富集区、AD酸性结构域、bHLH碱性螺旋-环-螺旋、LZ亮氨酸拉链结构域和Pro脯氨酸富集区段。在营养丰富的条件下，雷帕霉素靶蛋白复合物1 (mTORC1) 的机制靶点在溶酶体表面磷酸化Ser211，从而为14-3-3分子伴侣蛋白创造一个结合位点。这种相互作用掩盖了TFEB的核定位信号 (NLS)，将其隔离在细胞质中，并阻止其靶基因的转录激活。当细胞遭受应激或饥饿时，mTORC1活性降低，导致Ser211去磷酸化，TFEB从14-3-3蛋白上释放，并发生核易位。在那里，TFEB激活含有CLEAR基序的基因，增强自噬和溶酶体功能。因此，Ser211的磷酸化对于动态调节TFEB的活性以响应细胞代谢状态、维持能量稳态以及促进神经退行性疾病和肾脏疾病等疾病中的毒性底物清除至关重要。

使用信息

抗体应用 WB 稀释比例
WB
1:1000
反应性 Human
抗体类型 Rabbit MW 70 kDa
储存液配方 PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3
储存条件
(自收到货起)		 -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years
WB
实验步骤：
 
样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），低温匀浆。
2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。
3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。
4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
 
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表
2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
 
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；
4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表
湿转法参考条件：200 mA, 120 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
 
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液（建议使用 5% BSA溶液）中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
 
抗体孵育
1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；
2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
 
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
 

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