APAF1 Antibody [L11A23] Datasheet

生物描述

特异性	APAF1 Antibody [L11A23] 可检测内源性 APAF1 总蛋白水平。
背景	凋亡蛋白酶激活因子1 (APAF1) 是秀丽隐杆线虫CED-4的哺乳动物同源物，是内源性凋亡通路中的关键衔接蛋白，可形成凋亡体复合物，该复合物对于caspase的激活至关重要。APAF1包含一个N端CARD结构域（用于募集caspase-9）、一个中央CED-4同源结构域（包括核苷酸结合结构域和螺旋结构域）以及C端WD40重复序列（用于调节自身抑制）。其中，Arg265和Asp244等关键残基促进dATP的结合和水解，从而诱导构象激活。其主要功能是结合胞质细胞色素c和dATP/ATP，寡聚化形成轮状凋亡体，并通过CARD-CARD相互作用募集并激活procaspase-9，进而触发下游效应caspase（如caspase-3）的激活，最终执行细胞凋亡。这一过程是线粒体外膜通透性改变介导的细胞死亡的核心，在发育、组织稳态和应激反应中清除受损细胞。APAF1 的失调与多种疾病相关：其缺乏会导致细胞凋亡抵抗和增生，例如 Apaf-1 基因敲除小鼠；而过表达则会增强损伤后 p53 介导的神经元凋亡。APAF1 还作为先天免疫中的 DNA 传感器发挥作用，其带正电荷的 NB-ARC/WD40 表面能够结合胞质 DNA，随后细胞色素 c 的竞争作用会将 DNA 转移至凋亡小体组装。

特异性

APAF1 Antibody [L11A23] 可检测内源性 APAF1 总蛋白水平。

背景

凋亡蛋白酶激活因子1 (APAF1) 是秀丽隐杆线虫CED-4的哺乳动物同源物，是内源性凋亡通路中的关键衔接蛋白，可形成凋亡体复合物，该复合物对于caspase的激活至关重要。APAF1包含一个N端CARD结构域（用于募集caspase-9）、一个中央CED-4同源结构域（包括核苷酸结合结构域和螺旋结构域）以及C端WD40重复序列（用于调节自身抑制）。其中，Arg265和Asp244等关键残基促进dATP的结合和水解，从而诱导构象激活。其主要功能是结合胞质细胞色素c和dATP/ATP，寡聚化形成轮状凋亡体，并通过CARD-CARD相互作用募集并激活procaspase-9，进而触发下游效应caspase（如caspase-3）的激活，最终执行细胞凋亡。这一过程是线粒体外膜通透性改变介导的细胞死亡的核心，在发育、组织稳态和应激反应中清除受损细胞。APAF1 的失调与多种疾病相关：其缺乏会导致细胞凋亡抵抗和增生，例如 Apaf-1 基因敲除小鼠；而过表达则会增强损伤后 p53 介导的神经元凋亡。APAF1 还作为先天免疫中的 DNA 传感器发挥作用，其带正电荷的 NB-ARC/WD40 表面能够结合胞质 DNA，随后细胞色素 c 的竞争作用会将 DNA 转移至凋亡小体组装。

使用信息

抗体应用

WB, IP

稀释比例

WB	IP
1:1000	1:30

反应性

Mouse, Rat, Human

抗体类型

Rabbit Monoclonal Antibody

MW

141 kDa, 125 kDa

储存液配方

PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3

储存条件
(自收到货起)

-20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years

实验方法
WB	实验步骤：样品制备 1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液； 5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度； 6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。电泳分离 1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：5 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）转膜 1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中； 2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗； 3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表湿转法参考条件：200 mA, 120 min。（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）封闭 1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min； 2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温； 3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。抗体孵育 1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min； 3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h； 4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。显色 1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀； 2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

实验方法

WB

实验步骤：

样品制备

1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆。

2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。

3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。

4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；

5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；

6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。

电泳分离

1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：5 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表

2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）

转膜

1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；

2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；

3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；

4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表

湿转法参考条件：200 mA, 120 min。

（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）

封闭

1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；

2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；

3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

抗体孵育

1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；

2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；

3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；

4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

显色

1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；

2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

APAF1 Antibody [L11A23]

生物描述

使用信息

文献参考

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