Argonaute-2 Antibody [K4M16] Datasheet

生物描述

特异性	Argonaute-2 Antibody [K4M16] 可检测内源性 Argonaute-2 总蛋白水平。
背景	Argonaute-2（简称Ago2）是哺乳动物Argonaute蛋白家族（AGO1-4）中唯一具有内在核酸内切酶或切割活性的成员，使其成为RNA诱导沉默复合物（RISC）的核心效应分子。RISC利用microRNA、小干扰RNA（siRNA）和piwi相互作用RNA等小RNA作为向导，介导RNA干扰通路，从而实现基因沉默。Ago2具有双叶结构，由四个核心结构域组成：N结构域，负责向导链的解旋；PAZ结构域，锚定向导RNA的3'端；MID结构域，锚定5'端；以及PIWI结构域，其结构与RNase H相似，并具有催化活性。这些结构域通过L1和L2连接区连接。 PIWI结构域包含一个由天冬氨酸、谷氨酸和天冬氨酸残基组成的催化三联体，该三联体协调两个镁离子，这两个镁离子是mRNA在引导链第10和11位之间切割所必需的。种子配对区域中的特定残基，例如精氨酸635和谷氨酰胺633，通过在RNA双链中引入扭结来确保靶标特异性。Ago2在细胞质中装载成熟的双链miRNA或siRNA，根据热力学稳定性选择引导链，并将其穿过中央裂隙，在那里它与所有结构域和连接区相互作用以增强稳定性。根据互补程度，Ago2可以对完全匹配的靶标执行核酸内切酶切割，或者通过募集GW182来介导错配靶标的翻译抑制和去腺苷酸化。多个磷酸化位点调节Ago2的定位、RNA结合亲和力和沉默效率。 Ago2通过沉默大量人类基因，在发育、分化、细胞应激反应和基因组稳定性方面发挥着至关重要的作用。它与Dicer和TRBP协同调控RISC组装，并在染色质沉默中也扮演着重要角色。Ago2的失调可促进肿瘤发生，因为在多种癌症中均观察到其过表达，并且它通过稳定致癌性microRNA（如miR-21和miR-155）来增强细胞增殖和侵袭，同时它也与神经退行性疾病有关。

特异性

Argonaute-2 Antibody [K4M16] 可检测内源性 Argonaute-2 总蛋白水平。

背景

Argonaute-2（简称Ago2）是哺乳动物Argonaute蛋白家族（AGO1-4）中唯一具有内在核酸内切酶或切割活性的成员，使其成为RNA诱导沉默复合物（RISC）的核心效应分子。RISC利用microRNA、小干扰RNA（siRNA）和piwi相互作用RNA等小RNA作为向导，介导RNA干扰通路，从而实现基因沉默。Ago2具有双叶结构，由四个核心结构域组成：N结构域，负责向导链的解旋；PAZ结构域，锚定向导RNA的3'端；MID结构域，锚定5'端；以及PIWI结构域，其结构与RNase H相似，并具有催化活性。这些结构域通过L1和L2连接区连接。 PIWI结构域包含一个由天冬氨酸、谷氨酸和天冬氨酸残基组成的催化三联体，该三联体协调两个镁离子，这两个镁离子是mRNA在引导链第10和11位之间切割所必需的。种子配对区域中的特定残基，例如精氨酸635和谷氨酰胺633，通过在RNA双链中引入扭结来确保靶标特异性。Ago2在细胞质中装载成熟的双链miRNA或siRNA，根据热力学稳定性选择引导链，并将其穿过中央裂隙，在那里它与所有结构域和连接区相互作用以增强稳定性。根据互补程度，Ago2可以对完全匹配的靶标执行核酸内切酶切割，或者通过募集GW182来介导错配靶标的翻译抑制和去腺苷酸化。多个磷酸化位点调节Ago2的定位、RNA结合亲和力和沉默效率。 Ago2通过沉默大量人类基因，在发育、分化、细胞应激反应和基因组稳定性方面发挥着至关重要的作用。它与Dicer和TRBP协同调控RISC组装，并在染色质沉默中也扮演着重要角色。Ago2的失调可促进肿瘤发生，因为在多种癌症中均观察到其过表达，并且它通过稳定致癌性microRNA（如miR-21和miR-155）来增强细胞增殖和侵袭，同时它也与神经退行性疾病有关。

使用信息

抗体应用

WB, IP

稀释比例

WB	IP
1:1000	1:50

反应性

Human, Mouse, Rat, Monkey

抗体类型

Rabbit Monoclonal Antibody

MW

97 kDa

储存液配方

PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3

储存条件
(自收到货起)

-20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years

实验方法
WB	实验步骤：样品制备 1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液； 5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度； 6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。电泳分离 1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）转膜 1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中； 2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗； 3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表湿转法参考条件：200 mA, 120 min。（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）封闭 1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min； 2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温； 3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。抗体孵育 1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min； 3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h； 4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。显色 1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀； 2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

实验方法

WB

实验步骤：

样品制备

1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆。

2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。

3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。

4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；

5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；

6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。

电泳分离

1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表

2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）

转膜

1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；

2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；

3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；

4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表

湿转法参考条件：200 mA, 120 min。

（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）

封闭

1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；

2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；

3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

抗体孵育

1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；

2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；

3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；

4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

显色

1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；

2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

Argonaute-2 Antibody [K4M16]

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