Aromatase Antibody (Rabbit mAb) [D20L3]

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生物描述

特异性 Aromatase Antibody (Rabbit mAb) [D20L3] 可检测内源性 Aromatase 总蛋白水平。
背景 芳香化酶（由CYP19A1基因编码）是一种微粒体细胞色素P450单加氧酶，它催化雌激素生物合成的最后一步，将睾酮和雄烯二酮等C19雄激素转化为酚类C18雌激素，使其成为类固醇生成和雌激素信号传导的关键酶促节点，该过程涉及生殖和非生殖组织。该蛋白属于更广泛的P450家族，但其活性位点结构高度特化，支持连续的羟基化和氧化性C19去甲基化，最终实现A环的芳香化；其膜结合拓扑结构以及与NADPH-P450还原酶的结合构成了核心催化单元，该单元负责传递电子以进行这一多步反应。从机制上讲，芳香化酶对雄激素底物A环和B环之间的C19甲基进行三次连续的单加氧酶反应，生成羟基化中间体和醛，然后将C19碳裂解为甲酸，同时将A环重排为芳香结构，并将C3羰基转化为羟基，并在C2-C3处引入双键生成雌酮，雌酮随后可被还原为雌二醇。这一酶促反应序列定义了脂肪组织、乳腺、子宫内膜、卵巢和脑等组织中局部雌激素生成的限速步骤。在这些组织中，芳香化酶的表达对雌激素的可用性进行位点特异性控制，从而激活核雌激素受体通路，调控参与增殖、分化和代谢稳态的基因转录。CYP19A1的组织选择性表达由至少十个不同的启动子驱动，这些启动子响应不同的信号输入。在生理条件下，糖皮质激素反应性启动子I.4主要存在于皮下脂肪组织中；而cAMP反应性启动子I.3和II在激素依赖性乳腺癌的肿瘤周围成纤维细胞中被激活，从而将芳香化酶的表达转移到肿瘤微环境，并增加局部雌激素的生成。在激素受体阳性乳腺癌中，肿瘤上皮细胞和周围基质脂肪组织中的芳香化酶活性通常升高，导致乳腺中雌激素浓度达到或超过绝经前血浆水平，并驱动雌激素受体阳性肿瘤的自分泌和旁分泌生长。对乳腺肿瘤组织培养物中芳香化酶活性的测定及其与增殖细胞核抗原和胸苷掺入的相关性分析表明，芳香化酶活性较高的肿瘤对睾酮的反应更强，DNA合成增加，这表明由芳香化酶底物局部合成的雌激素直接参与增殖信号传导。启动子使用中的调控开关，以及细胞因子和生长因子的输入，特异性地增强恶性乳腺组织和癌细胞邻近成纤维细胞中芳香化酶的表达，从而建立了一种微环境，在该微环境中，CYP19A1介导的雌激素生成与肿瘤进展紧密相关，并为抑制剂治疗提供了一个明确的分子靶点。CYP19A1的种系功能缺失突变会导致芳香化酶缺乏，其特征是雌激素水平低下和雄激素水平升高，进而导致性发育紊乱、第二性征成熟受损、身材高大但骨龄延迟、骨质疏松和代谢紊乱，这表明人体骨骼、代谢和生殖生理功能依赖于芳香化酶生成的雌激素。

使用信息

抗体应用 WB, IHC, IF 稀释比例
WB IHC IF
1:500 - 1:5000 1:50 - 1:200 1:20 - 1:200
反应性 Human
抗体类型 Rabbit Monoclonal Antibody MW 58 kDa
储存液配方 PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3
储存条件
(自收到货起)		 -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years
WB
实验步骤：
 
样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。
2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。
3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。
4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
 
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表
2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
 
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；
4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表
湿转法参考条件：200 mA, 120 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
 
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
 
抗体孵育
1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:500），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；
2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
 
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
 
IHC
实验步骤：
 
脱蜡/补液
1. 脱蜡/水合切片：
2. 将切片在二甲苯中孵育 3 次，每次 5 分钟。
3. 将切片在 100% 乙醇中孵育两次，每次 10 分钟。
4. 将切片在 95% 乙醇洗涤液中孵育两次，每次 10 分钟。
5. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
6.抗原修复：对于柠檬酸盐：将载玻片浸入 1X 柠檬酸盐暴露溶液中，在微波炉中加热，直至开始沸腾； 在亚沸温度 (95°-98°C) 下继续煮 10 分钟。 在工作台上冷却玻片 30 分钟。
 
染色
1. 用 dH2O 清洗切片 3 次，每次 5 分钟。
2. 将切片在 3% 过氧化氢中孵育 10 分钟。
3. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
4. 在洗涤缓冲液中洗涤切片 5 分钟。
5. 用 100–400 µl 封闭液在室温下封闭每个切片 1 小时。
6. 除去封闭液，并向每个切片中添加 100–400 µl 一抗稀释液。 4°C 孵育过夜。
7. 去除抗体溶液，用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
8. 用 1-3 滴所需的 HRPA 覆盖切片。 在加湿室中室温孵育 30 分钟。
9. 用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
10. 使用前将 DAB 显色剂浓缩液加入 DAB 稀释液中并充分混合。
11. 在每个切片上涂抹 100–400 µl DAB 并密切监测。 1-10 分钟通常可提供可接受的染色强度。
12. 将载玻片浸入 dH2O 中。
13. 如果需要，用苏木精复染切片。
14. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
15. 切片脱水：95%乙醇孵育切片两次，每次 10 秒； 在 100% 乙醇中重复，孵育切片两次，每次 10 秒； 在二甲苯中重复，孵育切片两次，每次 10 秒。
16. 用盖玻片和封固剂封固切片。
 
IF
实验步骤：
样品准备
1. 贴壁细胞：取洁净无菌盖玻片置于培养皿中，待细胞接近长成单层后取出盖玻片。
2. 悬浮细胞：将细胞接种至多聚赖氨酸包被的洁净无菌载玻片上。
3. 冰冻切片：将玻片置于室温下解冻，纯水或 PBS 摇洗 3次，每次 3 min。
4. 石蜡切片：先将玻片脱蜡至水，纯水或 PBS 摇洗 3次，每次 3 min。然后进行抗原修复。
 
固定
1. 使用固定液，如4%多聚甲醛（4% PFA）室温固定细胞爬片/涂片或组织切片 10~15 min。
2. 使用 PBS 摇洗样品 3次，每次 3 min。
 
通透
1. 对样品添加去垢剂，如 0.1~0.3% Triton X-100，室温通透 10~20 min。
（仅针对胞内抗原，若是细胞膜上表达的抗原则可省略该步骤。）
2. 使用 PBS 摇洗样品 3次，每次 3 min。
 
封闭
添加封闭液，在室温下封闭至少 1 h。（常用的封闭液包括：与二抗同一来源的血清、BSA或山羊血清。）
注意事项：从封闭开始之后的所有步骤务必保证样品湿润，避免干燥，否则极易产生高背景。
 
免疫荧光染色（第一天）
1. 吸走封闭液，滴加稀释后的一抗。
2. 湿盒中 4°C 孵育过夜。
 
免疫荧光染色（第二天）
1. 吸走一抗，PBST 摇洗 3 次，每次 5 min。
2. 滴加稀释后的荧光二抗，避光 4°C 孵育 1~2 h。
3. 吸走二抗，PBST 摇洗 3 次，每次 5 min。
4. 滴加稀释后的 DAPI，室温避光 孵育 5~10 min。
5. PBST 中摇洗 3 次，每次 5 分钟。
 
封片
1. 抗荧光淬灭封片剂封片。
2. 干燥玻片，将玻片置于室温下避光过夜。
3. 将载玻片放入玻片盒中 4°C 避光保存。
 

Application Data

WB

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  • Lane 1: HepG2, Lane 2: 293T, Lane 3: SH-SY5Y, Lane 4: K562