Artemis Antibody [H20J21] Datasheet

生物描述

特异性	Artemis Antibody [H20J21] 可检测内源性 Artemis 总蛋白水平。
背景	Artemis（DCLRE1C，又名 SNM1C）是一种普遍表达的核核酸酶，属于金属β-内酰胺酶（MBL）超家族，对发育中的淋巴细胞的非同源末端连接（NHEJ）DNA修复和V(D)J重组至关重要。 Artemis 是一种由 692 个氨基酸组成的蛋白质，其 N 端催化结构域（残基 1-360）包含一个核心 MBL 折叠（α/β-β/α 三明治结构）和一个嵌入的 β-CASP 亚结构域，该亚结构域包含保守基序 1-4（His33、His35、His115、Asp116 与 Zn²⁺ 离子 M1/M2 配位）和用于核酸加工的基序 AC，以及一个主要无结构的 C 端调节尾（残基 361-692），该调节尾可自身抑制活性并介导 DNA-PKcs 连接。 DNA-PKcs在识别DSB后磷酸化Artemis（例如，Thr127、Ser251位点），激活其结构特异性核酸内切酶活性，从而在V(D)J重组中打开发夹结构封闭的编码末端，在NHEJ中修剪5'/3'突出端、瓣状结构和气泡，以利于XRCC4/LIG4连接，并处理IR诱导的复杂末端，同时通过53BP1-PTIP相互作用拮抗HR。ATM/ATR进一步磷酸化Artemis，以恢复G2/M期和S期检查点，促进Cdk1-cyclin B激活和cyclin E降解（通过SCF^Fbw7）。双等位基因突变会导致放射敏感性重症联合免疫缺陷（RS-SCID），伴有V(D)J连接缺陷和基因组不稳定，易患恶性肿瘤。

特异性

Artemis Antibody [H20J21] 可检测内源性 Artemis 总蛋白水平。

背景

Artemis（DCLRE1C，又名 SNM1C）是一种普遍表达的核核酸酶，属于金属β-内酰胺酶（MBL）超家族，对发育中的淋巴细胞的非同源末端连接（NHEJ）DNA修复和V(D)J重组至关重要。 Artemis 是一种由 692 个氨基酸组成的蛋白质，其 N 端催化结构域（残基 1-360）包含一个核心 MBL 折叠（α/β-β/α 三明治结构）和一个嵌入的 β-CASP 亚结构域，该亚结构域包含保守基序 1-4（His33、His35、His115、Asp116 与 Zn²⁺ 离子 M1/M2 配位）和用于核酸加工的基序 AC，以及一个主要无结构的 C 端调节尾（残基 361-692），该调节尾可自身抑制活性并介导 DNA-PKcs 连接。 DNA-PKcs在识别DSB后磷酸化Artemis（例如，Thr127、Ser251位点），激活其结构特异性核酸内切酶活性，从而在V(D)J重组中打开发夹结构封闭的编码末端，在NHEJ中修剪5'/3'突出端、瓣状结构和气泡，以利于XRCC4/LIG4连接，并处理IR诱导的复杂末端，同时通过53BP1-PTIP相互作用拮抗HR。ATM/ATR进一步磷酸化Artemis，以恢复G2/M期和S期检查点，促进Cdk1-cyclin B激活和cyclin E降解（通过SCF^Fbw7）。双等位基因突变会导致放射敏感性重症联合免疫缺陷（RS-SCID），伴有V(D)J连接缺陷和基因组不稳定，易患恶性肿瘤。

使用信息

抗体应用

WB, IP

稀释比例

WB	IP
1:1000	1:200

反应性

Human, Monkey

抗体类型

Rabbit Monoclonal Antibody

MW

90 kDa

储存液配方

PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3

储存条件
(自收到货起)

-20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years

实验方法
WB	实验步骤：样品制备 1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/Nuclear Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/Nuclear Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/Nuclear Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液； 5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度； 6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。电泳分离 1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）转膜 1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中； 2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗； 3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表湿转法参考条件：200 mA, 120 min。（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）封闭 1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min； 2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温； 3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。抗体孵育 1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min； 3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h； 4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。显色 1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀； 2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。(建议曝光时长 60s 以上)。

实验方法

WB

实验步骤：

样品制备

1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/Nuclear Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆。

2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/Nuclear Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。

3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/Nuclear Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。

4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；

5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；

6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。

电泳分离

1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表

2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）

转膜

1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；

2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；

3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；

4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表

湿转法参考条件：200 mA, 120 min。

（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）

封闭

1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；

2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；

3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

抗体孵育

1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；

2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；

3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；

4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

显色

1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；

2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。(建议曝光时长 60s 以上)。

文献参考

Application Data

WB

Validated by Selleck

Lane 1: Jurkat, Lane 2: HT-29, Lane 3: PC-3, Lane 4: MCF-7