Atg9A Antibody [L22J4] Datasheet

生物描述

特异性	Atg9A Antibody [L22J4] 可检测内源性 Atg9A 总蛋白水平。
背景	Atg9A 是一种多跨膜蛋白，属于自噬相关蛋白 (ATG) 家族，是酵母 Atg9 的哺乳动物同源蛋白。它是目前已知唯一一种整合膜的 ATG 蛋白，在多种细胞环境中对自噬体的生物合成至关重要。Atg9A 具有六个跨膜结构域，形成棕榈酰化的脂质转运支架，可在反式高尔基网络 (TGN)、内体、ω 体和吞噬泡之间动态循环，但不会稳定地整合到成熟的自噬体中。在 mTORC1 抑制或 ULK1 激活诱导自噬后，Atg9A 通过 AP1/AP4 衔接蛋白和 RUSC2 转运新生吞噬泡膜，并与 ATG2A-ATG18 协同作用，扩展富含 PI3P 的平台。同时，其 C 端尾部募集 IQGAP1 和 ESCRT-III 组分 CHMP2A，封闭吞噬泡开口，最终通过收缩和膜裂解完成自噬体的包裹，且该过程独立于经典的 LC3 脂化途径。这使得 Atg9A 成为 ULK1-ATG9-ATG2-WIPI2-PI3KC3 轴的中心枢纽。在该轴中，AMPK/ULK1 对 S761 位点的磷酸化可精细调控囊泡的输出和裂变，从而激活脂质扰乱酶活性，在饥饿、内质网应激或病原体入侵期间翻转磷脂，以产生曲率并选择性地包裹目标物质。它驱动神经元清除蛋白质聚集体、T细胞中免疫突触的形成以及肌肉的代谢适应，因此对于研究人员利用超分辨率追踪技术探索膜动力学或在类器官中解析非经典自噬过程具有不可估量的价值。功能缺失突变会损害神经发育和溶酶体贮积，从而导致神经退行性疾病和肌病。

特异性

Atg9A Antibody [L22J4] 可检测内源性 Atg9A 总蛋白水平。

背景

Atg9A 是一种多跨膜蛋白，属于自噬相关蛋白 (ATG) 家族，是酵母 Atg9 的哺乳动物同源蛋白。它是目前已知唯一一种整合膜的 ATG 蛋白，在多种细胞环境中对自噬体的生物合成至关重要。Atg9A 具有六个跨膜结构域，形成棕榈酰化的脂质转运支架，可在反式高尔基网络 (TGN)、内体、ω 体和吞噬泡之间动态循环，但不会稳定地整合到成熟的自噬体中。在 mTORC1 抑制或 ULK1 激活诱导自噬后，Atg9A 通过 AP1/AP4 衔接蛋白和 RUSC2 转运新生吞噬泡膜，并与 ATG2A-ATG18 协同作用，扩展富含 PI3P 的平台。同时，其 C 端尾部募集 IQGAP1 和 ESCRT-III 组分 CHMP2A，封闭吞噬泡开口，最终通过收缩和膜裂解完成自噬体的包裹，且该过程独立于经典的 LC3 脂化途径。这使得 Atg9A 成为 ULK1-ATG9-ATG2-WIPI2-PI3KC3 轴的中心枢纽。在该轴中，AMPK/ULK1 对 S761 位点的磷酸化可精细调控囊泡的输出和裂变，从而激活脂质扰乱酶活性，在饥饿、内质网应激或病原体入侵期间翻转磷脂，以产生曲率并选择性地包裹目标物质。它驱动神经元清除蛋白质聚集体、T细胞中免疫突触的形成以及肌肉的代谢适应，因此对于研究人员利用超分辨率追踪技术探索膜动力学或在类器官中解析非经典自噬过程具有不可估量的价值。功能缺失突变会损害神经发育和溶酶体贮积，从而导致神经退行性疾病和肌病。

使用信息

抗体应用

WB, IP

稀释比例

WB	IP
1:1000	1:50

反应性

Human, Mouse, Rat, Monkey

抗体类型

Rabbit Monoclonal Antibody

MW

100-110 kDa

储存液配方

PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3

储存条件
(自收到货起)

-20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years

实验方法
WB	实验步骤：样品制备 1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液； 5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度； 6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。电泳分离 1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）转膜 1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中； 2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗； 3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表湿转法参考条件：200 mA, 120 min。（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）封闭 1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min； 2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温； 3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。抗体孵育 1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min； 3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h； 4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。显色 1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀； 2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

实验方法

WB

实验步骤：

样品制备

1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆。

2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。

3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。

4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；

5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；

6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。

电泳分离

1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表

2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）

转膜

1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；

2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；

3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；

4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表

湿转法参考条件：200 mA, 120 min。

（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）

封闭

1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；

2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；

3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

抗体孵育

1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；

2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；

3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；

4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

显色

1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；

2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

文献参考

Application Data

WB

Validated by Selleck

Lane 1: DU145, Lane 2: Neuro-2a, Lane 3: H-4-II-E, Lane 4: MCF7