ATP6V1B2 Antibody [K16G16] Datasheet

生物描述

特异性	ATP6V1B2 Antibody [K16G16] 可检测内源性 ATP6V1B2 总蛋白水平。
背景	ATP6V1B2 是液泡 H+-ATPase (V-ATPase) 复合物中 V1 区的 B2 亚型，该复合物作为 ATP 驱动的质子泵，酸化溶酶体、内体等细胞内区室以及某些质膜。它与 A 亚基共同构成外周 V1 结构域的催化六聚体，该六聚体具有核苷酸结合位点，可驱动旋转 ATP 水解，从而为质子通过膜嵌入的 V0 区转运提供动力。含有 ATP6V1B2 的 V-ATPase 直接与溶酶体表面的 Ragulator-Rag GTPase 复合物相互作用，感知氨基酸的可用性，从而触发 mTORC1 的募集和激活；在亮氨酸或精氨酸刺激下，V-ATPase质子泵产生局部酸性微环境，稳定RagA/B的GTP结合状态，促进mTORC1通过Raptor与mTORC1对接，并随后磷酸化S6K1/4EBP1，从而促进合成代谢翻译，同时抑制分解代谢。这种质子梯度还将溶酶体生物合成与营养信号传导相偶联。ATP6V1B2突变会损害酸化作用，破坏自噬通量，但矛盾的是，它通过改变v-ATPase的解离-重组动力学来维持mTORC1活性。ATP6V1B2通过协调溶酶体降解与生长决策，在营养波动的环境中维持细胞稳态，使其成为研究氨基酸感知或巨胞饮作用的理想靶点，因为v-ATPase抑制揭示了mTORC1依赖性。体细胞突变引起的失调激活自噬，同时保留 mTORC1，有助于 B 细胞淋巴瘤在亮氨酸缺乏的情况下存活，而导致远端肾小管酸中毒的变异则表现出酸碱平衡受损。

特异性

ATP6V1B2 Antibody [K16G16] 可检测内源性 ATP6V1B2 总蛋白水平。

背景

ATP6V1B2 是液泡 H+-ATPase (V-ATPase) 复合物中 V1 区的 B2 亚型，该复合物作为 ATP 驱动的质子泵，酸化溶酶体、内体等细胞内区室以及某些质膜。它与 A 亚基共同构成外周 V1 结构域的催化六聚体，该六聚体具有核苷酸结合位点，可驱动旋转 ATP 水解，从而为质子通过膜嵌入的 V0 区转运提供动力。含有 ATP6V1B2 的 V-ATPase 直接与溶酶体表面的 Ragulator-Rag GTPase 复合物相互作用，感知氨基酸的可用性，从而触发 mTORC1 的募集和激活；在亮氨酸或精氨酸刺激下，V-ATPase质子泵产生局部酸性微环境，稳定RagA/B的GTP结合状态，促进mTORC1通过Raptor与mTORC1对接，并随后磷酸化S6K1/4EBP1，从而促进合成代谢翻译，同时抑制分解代谢。这种质子梯度还将溶酶体生物合成与营养信号传导相偶联。ATP6V1B2突变会损害酸化作用，破坏自噬通量，但矛盾的是，它通过改变v-ATPase的解离-重组动力学来维持mTORC1活性。ATP6V1B2通过协调溶酶体降解与生长决策，在营养波动的环境中维持细胞稳态，使其成为研究氨基酸感知或巨胞饮作用的理想靶点，因为v-ATPase抑制揭示了mTORC1依赖性。体细胞突变引起的失调激活自噬，同时保留 mTORC1，有助于 B 细胞淋巴瘤在亮氨酸缺乏的情况下存活，而导致远端肾小管酸中毒的变异则表现出酸碱平衡受损。

使用信息

抗体应用

WB

稀释比例

WB

1:1000

反应性

Human, Mouse, Rat, Monkey

抗体类型

Rabbit Monoclonal Antibody

MW

55 kDa

储存液配方

PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3

储存条件
(自收到货起)

-20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years

实验方法
WB	实验步骤：样品制备 1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液； 5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度； 6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。电泳分离 1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）转膜 1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中； 2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗； 3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表湿转法参考条件：200 mA, 120 min。（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）封闭 1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min； 2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温； 3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。抗体孵育 1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min； 3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h； 4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。显色 1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀； 2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

实验方法

WB

实验步骤：

样品制备

1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆。

2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。

3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。

4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；

5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；

6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。

电泳分离

1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表

2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）

转膜

1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；

2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；

3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；

4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表

湿转法参考条件：200 mA, 120 min。

（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）

封闭

1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；

2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；

3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

抗体孵育

1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；

2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；

3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；

4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

显色

1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；

2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

文献参考

Application Data

WB

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Lane 1: 293, Lane 2: ACHN, Lane 3: COS-7, Lane 4: vero