目录号：F1076

打印

生物描述

特异性 Brd4 Rabbit mAb 可识别总 Brd4 蛋白的内源水平。
背景 BRD4 是参与胚胎发生和癌症发展的重要调节因子。 BRD4 与其他 BET 家族成员一样，拥有两个连续的溴结构域（BD1、BD2），可与各种蛋白质（包括组蛋白）上的乙酰化赖氨酸残基结合。 这种相互作用使得 BRD4 能够沿着染色质聚集在高度乙酰化的组蛋白区域上，从而促进基因转录起始和延伸。 它还在 DNA 损伤修复和端粒稳态中发挥非转录作用，影响癌细胞的生长和存活。 在胚胎发生过程中，BRD4 对于保持干细胞多能性和通过调节谱系特异性基因来确定细胞身份至关重要。 此外，BRD4作为转录激活剂的作用对于各种发育过程（例如脂肪生成和肌肉生成）至关重要，强调了其在调节基因表达方面的重要性。

使用信息

抗体应用 WB, IHC, IP, FCM 稀释比例
WB IP IHC
1:1/200 - 1/1000 1:50 - 1:200 1:100 - 1:500
反应性 Mouse, Human
抗体类型 Rabbit MW 152 kDa
储存液配方 PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3
储存条件
(自收到货起)		 –20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years
WB
Western Blotting
 
样品制备
1. 吸去培养基,用1X PBS清洗细胞。
2. 加入1X SDS上样缓冲液裂解细胞,将提取物转移至微量离心管中。置于冰上。
3. 超声10–15秒,完成细胞裂解和DNA剪切。
4. 将20 µl样品在95–100°C加热5分钟,然后置于冰上冷却。
5. 离心5分钟(使用微量离心机)。
6. 将适量样品上样至SDS-PAGE凝胶(上样量取决于提取蛋白浓度)。注意:同时请上样预染分子量标准,以确定分子量并验证电转效果。
7. 电转至硝酸纤维素膜/PVDF膜。
 
膜封闭与抗体孵育
a. 封闭
1. (可选)转膜完成后,用TBS室温洗膜5分钟。
2. 将膜在封闭液中室温孵育1小时。
3. 用TBST洗涤3次,每次5分钟。
 
b. 抗体孵育
1. 将膜与一抗(按推荐的稀释度和稀释液配制)置于一抗稀释缓冲液中,4°C温和摇床过夜孵育。
2. 用TBST洗涤3次,每次5分钟。
3. 将膜与适当的二抗(稀释于封闭液中)在室温下温和摇床孵育1小时。
4. 用TBST洗涤3次,每次5分钟。
5. 进行检测。
 
显影检测
1. 抗体孵育结束后,用TBST洗膜3次,每次5分钟。
2. 配制ECL发光试剂(或根据二抗类型选择其他显色剂/底物)。混匀。
3. 将底物与膜孵育1分钟,去除多余溶液(膜保持湿润),置于显影仪中进行曝光。
IF
实验步骤：
 
标本制备
1. 吸出液体，然后用 1X PBS 稀释的 4% 多聚甲醛覆盖细胞至 2-3 mm 的深度。
注意：多聚甲醛有毒，只能在通风橱中使用。
2. 室温固定细胞 15 分钟。
3. 吸出固定液，用 1X PBS 冲洗 3 次，每次 5 分钟。
4. 继续进行免疫染色。
 
免疫染色
1. 添加封闭缓冲液并在室温下孵育 60 分钟。
2. 按照建议在抗体稀释缓冲液中制备一抗稀释液。
3. 吸出封闭液，加入制备好的一抗稀释液。
4. 4°C 孵育过夜。
5. 在 1X PBS 中冲洗 3 次，每次 5 分钟。
6. 将样本放入用抗体稀释缓冲液稀释的荧光染料偶联二抗中，室温避光孵育 1-2 小时。
7. 在 1X PBS 中冲洗 3 次，每次 5 分钟。
8. 使用带有 DAPI 的封固剂封固载玻片并盖上盖玻片。
9. 为获得最佳效果，请让封固剂在室温下固化过夜。 如需长期保存，请将载玻片平放在 4°C 避光保存。
 
IHC
实验步骤：
 
脱蜡/补液
1. 脱蜡/水合切片：
2. 将切片在二甲苯中孵育 3 次，每次 5 分钟。
3. 将切片在 100% 乙醇中孵育两次，每次 10 分钟。
4. 将切片在 95% 乙醇洗涤液中孵育两次，每次 10 分钟。
5. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
6.抗原修复：对于柠檬酸盐：将载玻片浸入 1X 柠檬酸盐暴露溶液中，在微波炉中加热，直至开始沸腾； 在亚沸温度 (95°-98°C) 下继续煮 10 分钟。 在工作台上冷却玻片 30 分钟。
 
染色
1. 用 dH2O 清洗切片 3 次，每次 5 分钟。
2. 将切片在 3% 过氧化氢中孵育 10 分钟。
3. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
4. 在洗涤缓冲液中洗涤切片 5 分钟。
5. 用 100–400 µl 封闭液在室温下封闭每个切片 1 小时。
6. 除去封闭液，并向每个切片中添加 100–400 µl 一抗稀释液。 4°C 孵育过夜。
7. 去除抗体溶液，用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
8. 用 1-3 滴所需的 HRPA 覆盖切片。 在加湿室中室温孵育 30 分钟。
9. 用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
10. 使用前将 DAB 显色剂浓缩液加入 DAB 稀释液中并充分混合。
11. 在每个切片上涂抹 100–400 µl DAB 并密切监测。 1-10 分钟通常可提供可接受的染色强度。
12. 将载玻片浸入 dH2O 中。
13. 如果需要，用苏木精复染切片。
14. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
15. 切片脱水：95%乙醇孵育切片两次，每次 10 秒； 在 100% 乙醇中重复，孵育切片两次，每次 10 秒； 在二甲苯中重复，孵育切片两次，每次 10 秒。
16. 用盖玻片和封固剂封固切片。
 

Application Data

IHC

Validated by Selleck

  • Immunohistochemical analysis of formalin fixed paraffin embedded human prostate cancer tissue with F1076 at 1/200 dilution.

WB

Validated by Selleck

  • Lane 1: HAP1
    Lane 2: HAP1 (koBrd4)
    Lane 3: HeLa