Caspase-1 Antibody [C2H20] Datasheet

生物描述

特异性	Caspase-1 Antibody [C2H20] 可检测内源性 Caspase-1 总蛋白水平。
背景	半胱天冬酶-1（白细胞介素-1β转化酶，ICE）与半胱天冬酶-4、-5、-11和-12同属半胱天冬酶家族，是一种炎症性半胱氨酸蛋白酶。它以无活性的45 kDa前体酶形式合成，对先天免疫反应至关重要。半胱天冬酶-1具有一个用于炎症小体组装的N端半胱天冬酶募集结构域（CARD）、一个含有催化半胱氨酸残基的大p20亚基和一个小p10亚基。这三个亚基通过邻近诱导的二聚化和自身蛋白水解切割形成一个活性异源四聚体(p20)₂(p10)₂。 Caspase-1 在病原体相关分子模式或损伤信号触发的多蛋白炎症小体（NLRP3、AIM2、NLRC4/ASC）内被激活，特异性地将前体IL-1β和前体IL-18切割成成熟的促炎细胞因子，从而驱动发热、炎症和适应性免疫反应。同时，Caspase-1 还加工 gasdermin D，通过 N 端孔道形成诱导细胞焦亡，导致细胞溶解性死亡和 IL-1 释放。Caspase-1 缺陷会选择性地损害细胞因子成熟，并赋予细胞对内毒素休克的抵抗力，但不影响细胞凋亡。

特异性

Caspase-1 Antibody [C2H20] 可检测内源性 Caspase-1 总蛋白水平。

背景

半胱天冬酶-1（白细胞介素-1β转化酶，ICE）与半胱天冬酶-4、-5、-11和-12同属半胱天冬酶家族，是一种炎症性半胱氨酸蛋白酶。它以无活性的45 kDa前体酶形式合成，对先天免疫反应至关重要。半胱天冬酶-1具有一个用于炎症小体组装的N端半胱天冬酶募集结构域（CARD）、一个含有催化半胱氨酸残基的大p20亚基和一个小p10亚基。这三个亚基通过邻近诱导的二聚化和自身蛋白水解切割形成一个活性异源四聚体(p20)₂(p10)₂。 Caspase-1 在病原体相关分子模式或损伤信号触发的多蛋白炎症小体（NLRP3、AIM2、NLRC4/ASC）内被激活，特异性地将前体IL-1β和前体IL-18切割成成熟的促炎细胞因子，从而驱动发热、炎症和适应性免疫反应。同时，Caspase-1 还加工 gasdermin D，通过 N 端孔道形成诱导细胞焦亡，导致细胞溶解性死亡和 IL-1 释放。Caspase-1 缺陷会选择性地损害细胞因子成熟，并赋予细胞对内毒素休克的抵抗力，但不影响细胞凋亡。

使用信息

抗体应用

WB, IP

稀释比例

WB	IP
1:1000	1:200

反应性

Mouse

抗体类型

Rabbit Monoclonal Antibody

MW

48 kDa

储存液配方

PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3

储存条件
(自收到货起)

-20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years

实验方法
WB	实验步骤：样品制备 1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液； 5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度； 6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。电泳分离 1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）转膜 1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中； 2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗； 3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表湿转法参考条件：200 mA, 120 min。（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）封闭 1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min； 2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温； 3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。抗体孵育 1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min； 3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h； 4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。显色 1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀； 2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

实验方法

WB

实验步骤：

样品制备

1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆。

2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。

3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。

4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；

5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；

6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。

电泳分离

1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表

2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）

转膜

1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；

2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；

3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；

4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表

湿转法参考条件：200 mA, 120 min。

（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）

封闭

1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；

2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；

3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

抗体孵育

1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；

2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；

3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；

4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

显色

1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；

2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

文献参考

Application Data

WB

Validated by Selleck

Lane 1: A20, Lane 2: EL4, Lane 3: J774A.1