Cdc20 Antibody (Rabbit mAb) [L21M22]

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生物描述

特异性 Cdc20 Antibody (Rabbit mAb) [L21M22] 可检测内源性 Cdc20 总蛋白水平。
背景 Cdc20 是一种进化上保守的 WD40 重复蛋白，在有丝分裂早期作为后期促进复合物/细胞周期蛋白体 (APC/C) 的主要激活因子和底物适配器发挥作用。它控制着关键有丝分裂调节因子的泛素依赖性降解，从而协调中期-后期转换、染色体分离和有丝分裂结束。该蛋白包含一个 N 端 C 盒和一个 C 端七叶 WD40 β 螺旋桨结构域，它们共同为 APC/C、底物（如 securin 和 cyclin B）中的破坏基序（D 盒和 KEN 盒）以及包括纺锤体检查点蛋白在内的调节因子提供结合位点。此外，CRY 盒等其他序列基序通过调节 Cdc20 与抑制复合物的结合，参与检查点信号传导。在有丝分裂中期，Cdc20 与 APC/C 结合形成 APC/C^Cdc20，这是一种 E3 连接酶复合物，它与 UbcH10 等 E2 酶协同作用，使 securin 和 cyclin B 多聚泛素化，从而触发分离酶激活和粘连蛋白切割，使姐妹染色单体分离，并启动 cyclin B 降解，促进进入后期和末期；多种机制，包括磷酸化、空间调控和纺锤体组装检查点 (SAC) 控制，确保 Cdc20-APC/C 活性受到抑制，直到所有染色体都达到正确的双极附着。 SAC 通过有丝分裂检查点复合物 (MCC) 的组装汇聚到 Cdc20 上。MCC 是一个异源四聚体，包含 MAD2、BUBR1、BUB3 和 Cdc20 分子，它结合并抑制 APC/C^Cdc20，阻止 securin 和细胞周期蛋白 B 的泛素化，同时未连接的着丝粒发出信号；结构和功能研究区分了 APC 结合的 Cdc20 (CDC20^A) 和 MCC 结合的 Cdc20 (CDC20^M)，对 Cdc20 基序的清晰解析表明，CRY 盒对于有效的 MCC 形成和检查点信号传导至关重要，这强化了 Cdc20 是着丝粒衍生的 SAC 信号整合到 APC/C 输出中的核心观点。除了在有丝分裂中期-后期转换中的经典作用外，Cdc20 还被证实可通过与 APC/C-CBP/p300 复合物发生物理相互作用，并以细胞周期特异性的方式将其募集到 UbcH10 启动子上，从而转录上调 UbcH10 的表达。这表明 Cdc20 可以作为转录共调节因子，协调其 E2 伴侣的表达与有丝分裂进程，并可能在增殖细胞中增强 APC/C 的活性。在癌症生物学中，Cdc20 在多种实体瘤和血液系统恶性肿瘤中经常过表达，并且在许多实体瘤中，高水平的 Cdc20 与基因组不稳定性和较差的总体生存率相关，这与其在染色体分离保真度和细胞周期进程之间的关键作用相一致。 Rb-E2F1轴的失调可上调Cdc20并激活APC/C^Cdc20转录，从而促进染色体不稳定和非整倍体。在胃癌及其癌前病变中，免疫组织化学研究表明，MAD2和Cdc20在高级别异型增生中表达最高，其中Cdc20特异性地标记胞中胞（胞吞）结构的外层细胞，其过表达与肠道组织学特征以及良好的无复发生存期和癌症特异性生存期相关，提示Cdc20的水平和定位既可作为染色体不稳定型肿瘤的标志物，也可作为不同临床病理行为的指标。使用 Apcin 和 proTAME 等小分子 APC/C^Cdc20 抑制剂的临床前研究表明，阻断 Cdc20 功能可诱导淋巴瘤和多发性骨髓瘤细胞的有丝分裂停滞和凋亡，并与临床相关药物产生协同作用，这凸显了靶向 Cdc20–APC/C 治疗依赖高 Cdc20 活性进行不受控制的细胞分裂的恶性肿瘤的治疗潜力。

使用信息

抗体应用 WB, IP, IHC, FCM 稀释比例
WB IP IHC FCM
1:1000 1:30 1:100 1:50
反应性 Human, Mouse, Rat
抗体类型 Rabbit Monoclonal Antibody MW 55 kDa
储存液配方 PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3
储存条件
(自收到货起)		 -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years
WB
实验步骤：
 
样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。
2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。
3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。
4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
 
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表
2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
 
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；
4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表
湿转法参考条件：200 mA, 120 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
 
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
 
抗体孵育
1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；
2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
 
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
 
IHC
实验步骤：
 
脱蜡/补液
1. 脱蜡/水合切片：
2. 将切片在二甲苯中孵育 3 次，每次 5 分钟。
3. 将切片在 100% 乙醇中孵育两次，每次 10 分钟。
4. 将切片在 95% 乙醇洗涤液中孵育两次，每次 10 分钟。
5. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
6.抗原修复：对于柠檬酸盐：将载玻片浸入 1X 柠檬酸盐暴露溶液中，在微波炉中加热，直至开始沸腾； 在亚沸温度 (95°-98°C) 下继续煮 10 分钟。 在工作台上冷却玻片 30 分钟。
 
染色
1. 用 dH2O 清洗切片 3 次，每次 5 分钟。
2. 将切片在 3% 过氧化氢中孵育 10 分钟。
3. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
4. 在洗涤缓冲液中洗涤切片 5 分钟。
5. 用 100–400 µl 封闭液在室温下封闭每个切片 1 小时。
6. 除去封闭液，并向每个切片中添加 100–400 µl 一抗稀释液。 4°C 孵育过夜。
7. 去除抗体溶液，用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
8. 用 1-3 滴所需的 HRPA 覆盖切片。 在加湿室中室温孵育 30 分钟。
9. 用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
10. 使用前将 DAB 显色剂浓缩液加入 DAB 稀释液中并充分混合。
11. 在每个切片上涂抹 100–400 µl DAB 并密切监测。 1-10 分钟通常可提供可接受的染色强度。
12. 将载玻片浸入 dH2O 中。
13. 如果需要，用苏木精复染切片。
14. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
15. 切片脱水：95%乙醇孵育切片两次，每次 10 秒； 在 100% 乙醇中重复，孵育切片两次，每次 10 秒； 在二甲苯中重复，孵育切片两次，每次 10 秒。
16. 用盖玻片和封固剂封固切片。
 

Application Data

WB

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  • Lane 1: HeLa, Lane 2: PC3, Lane 3: DU145, Lane 4: LNCaP