Cleaved Caspase-7 (Asp198) Rabbit mAb

目录号：F0275

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生物描述

特异性

仅当 Asp198 位点被切割时，Cleaved Caspase-7 (Asp198) Rabbit mAb 才能检测内源性总 caspase-7 蛋白的水平。
背景

Caspase-7 是天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶家族中进化保守的成员，最初被认为与 caspase-3 无关，因为它们共享最佳肽识别序列和共同的内源性蛋白质底物。在死亡受体或 DNA 损伤诱导的细胞凋亡过程中，这两种 caspase 均由启动子 caspase-8 和 -9 激活。Caspase-7 通过切割下游底物（如聚（ADP-核糖）聚合酶 (PARP)）在执行细胞凋亡中起重要作用，类似于 caspase-3。caspase-7 的激活涉及上游 caspase 在 Asp23、Asp198 和 Asp206 处的蛋白水解加工，以产生成熟的亚基。 Caspase-7 参与两种不同的凋亡信号通路：外在通路，由死亡受体配体启动，如 Fas 配体 (FasL) 和 TNF 相关凋亡诱导配体 (TRAIL)，以及内在通路。在外在通路中，受体聚集将死亡信号传递到细胞溶胶，激活 caspase-8 和 -10，进而处理执行者 caspase-3 和 -7。除了在凋亡中的作用外，caspase-7 的蛋白水解成熟在炎症条件下也观察到。

使用信息

抗体应用 WB, IF, FCM 稀释比例
WB IF FCM
1:1000 1:1600 1:1600
反应性 Human, Mouse, Rat
抗体类型 Rabbit MW 18 kDa
储存液配方 PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3
储存条件
(自收到货起)		 –20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years
WB

Western Blotting

 
样品制备
1. 吸去培养基,用1X PBS清洗细胞。
2. 加入1X SDS上样缓冲液裂解细胞,将提取物转移至微量离心管中。置于冰上。
3. 超声10–15秒,完成细胞裂解和DNA剪切。
4. 将20 µl样品在95–100°C加热5分钟,然后置于冰上冷却。
5. 离心5分钟(使用微量离心机)。
6. 将适量样品上样至SDS-PAGE凝胶(上样量取决于提取蛋白浓度)。注意:同时请上样预染分子量标准,以确定分子量并验证电转效果。
7. 电转至硝酸纤维素膜/PVDF膜。(湿转法参考条件: 150mA 50min)
 
膜封闭与抗体孵育
a. 封闭
1. (可选)转膜完成后,用TBS室温洗膜5分钟。
2. 将膜在封闭液中室温孵育1小时。
3. 用TBST洗涤3次,每次5分钟。
 
b. 抗体孵育
1. 将膜与一抗(按推荐的稀释度和稀释液配制)置于一抗稀释缓冲液中,4°C温和摇床过夜孵育。
2. 用TBST洗涤3次,每次5分钟。
3. 将膜与适当的二抗(稀释于封闭液中)在室温下温和摇床孵育1小时。
4. 用TBST洗涤3次,每次5分钟。
5. 进行检测。
 
显影检测
1. 抗体孵育结束后,用TBST洗膜3次,每次5分钟。
2. 配制ECL发光试剂(或根据二抗类型选择其他显色剂/底物)。混匀。
3. 将底物与膜孵育1分钟,去除多余溶液(膜保持湿润),置于显影仪中进行曝光。
IF

实验步骤：

 
标本制备
1. 吸出液体，然后用 1X PBS 稀释的 4% 多聚甲醛覆盖细胞至 2-3 mm 的深度。
注意：多聚甲醛有毒，只能在通风橱中使用。
2. 室温固定细胞 15 分钟。
3. 吸出固定液，用 1X PBS 冲洗 3 次，每次 5 分钟。
4. 继续进行免疫染色。
 
免疫染色
1. 添加封闭缓冲液并在室温下孵育 60 分钟。
2. 按照建议在抗体稀释缓冲液中制备一抗稀释液。
3. 吸出封闭液，加入制备好的一抗稀释液。
4. 4°C 孵育过夜。
5. 在 1X PBS 中冲洗 3 次，每次 5 分钟。
6. 将样本放入用抗体稀释缓冲液稀释的荧光染料偶联二抗中，室温避光孵育 1-2 小时。
7. 在 1X PBS 中冲洗 3 次，每次 5 分钟。
8. 使用带有 DAPI 的封固剂封固载玻片并盖上盖玻片。
9. 为获得最佳效果，请让封固剂在室温下固化过夜。 如需长期保存，请将载玻片平放在 4°C 避光保存。

Application Data

WB

Validated by Selleck

  • Lane 1: HeLa
    Lane 2: HeLa (Staurosporine , 1 μM, 3 hr)
    Lane 3: C2C12
    Lane 4: C2C12 (Staurosporine, 1 μM, 3 hr)