Cyclin D1 (C-terminal) Rabbit mAb Datasheet

生物描述

特异性	Cyclin D1 (C-terminal) Rabbit mAb 检测内源性 Cyclin D1 总的蛋白水平。
背景	细胞周期关键调控因子 Cyclin D1 通过驱动不受控制的细胞增殖在癌症发展中发挥关键作用。它是一种 36 kDa 蛋白质，由位于 11q13 染色体上的 CCND1 基因编码。从结构上讲，Cyclin D1 包含一个 RB 蛋白结合域、一个用于结合细胞周期依赖性激酶 (CDK) 或其抑制因子的区域、一个用于辅助激活因子募集的 LxxLL 基序、一个用于降解的 PEST 序列和一个调控核输出和蛋白质稳定性的关键苏氨酸残基。除了来自骨髓干细胞系的细胞外，Cyclin D1 在大多数正常人细胞中都有表达。生长因子可快速诱导其表达，使其能够整合和调控控制细胞增殖的多种细胞内信号通路。Cyclin D1 表达、积累、泛素化和与其同源 CDK 组装的失调会导致细胞过度生长，从而使 Cyclin D1 成为癌症的致癌驱动因素如乳腺癌、肺癌和黑色素瘤。虽然其表达在正常细胞中受到严格调控，但癌细胞会利用各种机制来放大 Cyclin D1 活性。Cyclin D1 通过充当 CDK4 和 CDK6 的变构调控因子来促进 G1 到 S 阶段的转变。活性 Cyclin D1/CDK4 复合物进入细胞核，在那里它与 Cyclin E/CDK2 共同磷酸化视网膜母细胞瘤 (RB) 蛋白。这种磷酸化释放了 RB 介导的 E2F 转录因子抑制，从而实现了细胞增殖所必需的基因的转录。Cyclin D1 水平升高会导致不受控制的增殖和肿瘤生长，强调其在癌症发病机制中的核心作用。除了其典型的 CDK 依赖性功能外，Cyclin D1 还表现出 CDK 非依赖性活性，充当转录调控因子。它通过与各种转录因子相互作用来影响细胞周期控制和增殖。细胞周期蛋白 D1 还与核受体（如 ERα、AR、过氧化物酶体增殖激活受体γ (PPARγ)、甲状腺激素受体β (TR-β)）及其共调控因子相互作用，影响细胞周期、生长和分化。此外，它控制特定微小 RNA (miRNA) 的表达，并显著促进肿瘤-基质相互作用，从而放大各种癌症特征。细胞周期蛋白 D1 在癌症发生和发展中的多方面作用反映了其作为 CDK 依赖性和 CDK 非依赖性细胞功能调控因子的复杂性。

特异性

Cyclin D1 (C-terminal) Rabbit mAb 检测内源性 Cyclin D1 总的蛋白水平。

背景

细胞周期关键调控因子 Cyclin D1 通过驱动不受控制的细胞增殖在癌症发展中发挥关键作用。它是一种 36 kDa 蛋白质，由位于 11q13 染色体上的 CCND1 基因编码。从结构上讲，Cyclin D1 包含一个 RB 蛋白结合域、一个用于结合细胞周期依赖性激酶 (CDK) 或其抑制因子的区域、一个用于辅助激活因子募集的 LxxLL 基序、一个用于降解的 PEST 序列和一个调控核输出和蛋白质稳定性的关键苏氨酸残基。除了来自骨髓干细胞系的细胞外，Cyclin D1 在大多数正常人细胞中都有表达。生长因子可快速诱导其表达，使其能够整合和调控控制细胞增殖的多种细胞内信号通路。Cyclin D1 表达、积累、泛素化和与其同源 CDK 组装的失调会导致细胞过度生长，从而使 Cyclin D1 成为癌症的致癌驱动因素如乳腺癌、肺癌和黑色素瘤。虽然其表达在正常细胞中受到严格调控，但癌细胞会利用各种机制来放大 Cyclin D1 活性。Cyclin D1 通过充当 CDK4 和 CDK6 的变构调控因子来促进 G1 到 S 阶段的转变。活性 Cyclin D1/CDK4 复合物进入细胞核，在那里它与 Cyclin E/CDK2 共同磷酸化视网膜母细胞瘤 (RB) 蛋白。这种磷酸化释放了 RB 介导的 E2F 转录因子抑制，从而实现了细胞增殖所必需的基因的转录。Cyclin D1 水平升高会导致不受控制的增殖和肿瘤生长，强调其在癌症发病机制中的核心作用。除了其典型的 CDK 依赖性功能外，Cyclin D1 还表现出 CDK 非依赖性活性，充当转录调控因子。它通过与各种转录因子相互作用来影响细胞周期控制和增殖。细胞周期蛋白 D1 还与核受体（如 ERα、AR、过氧化物酶体增殖激活受体γ (PPARγ)、甲状腺激素受体β (TR-β)）及其共调控因子相互作用，影响细胞周期、生长和分化。此外，它控制特定微小 RNA (miRNA) 的表达，并显著促进肿瘤-基质相互作用，从而放大各种癌症特征。细胞周期蛋白 D1 在癌症发生和发展中的多方面作用反映了其作为 CDK 依赖性和 CDK 非依赖性细胞功能调控因子的复杂性。

使用信息

抗体应用

WB, IP, IHC, IF

稀释比例

WB	IP	IHC	IF
1:10000	1:30	1:100 - 1:500	1:50

反应性

Human, Mouse, Rat

抗体类型

Rabbit

MW

34 kDa

储存液配方

PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN₃

储存条件
(自收到货起)

-20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years

实验方法
WB	实验步骤：样品制备 1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含PMSF），低温匀浆。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含PMSF），冰上静置裂解 5 min。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含PMSF），冰上静置裂解 5 min。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液； 5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度； 6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。电泳分离 1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）转膜 1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中； 2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗； 53.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜）。 PVDF 膜孔径规格选择参照表湿转法参考条件：200 mA, 60 min。（电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）封闭 1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min； 2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温； 3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。抗体孵育 1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:10000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min； 3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h； 4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。显色 1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀； 2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

实验方法

WB

实验步骤：

样品制备

1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含PMSF），低温匀浆。

2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含PMSF），冰上静置裂解 5 min。

3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含PMSF），冰上静置裂解 5 min。

4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；

5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；

6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。

电泳分离

1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表

2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）

转膜

1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；

2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；

53.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；

4.将蛋白电转移至 PVDF膜上（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜）。 PVDF 膜孔径规格选择参照表

湿转法参考条件：200 mA, 60 min。（电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）

封闭

1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；

2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；

3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

抗体孵育

1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:10000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；

2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；

3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；

4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

显色

1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；

2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

文献参考

[1] Montalto FI, et al. Cells. 2020 Dec 9;9(12):2648.

Application Data

WB

Validated by Selleck

Lane 1: A549
Lane 2: A549 (KO CCND1)
Lane 3: SH-SY5Y
Lane 4: Mouse kidney
Lane 5: Mouse spleen
Lane 6: Rat heart