DC-SIGNR Antibody (Rabbit mAb) [N17H7]

目录号：F9047

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生物描述

特异性 DC-SIGNR Antibody (Rabbit mAb) [N17H7] 可检测内源性 DC-SIGNR 总蛋白水平。
背景 DC-SIGNR（也称为CD209L或L-SIGN）是DC-SIGN家族的II型跨膜C型凝集素受体，主要表达于内皮细胞，尤其是在肝脏和淋巴结窦中。它作为一种黏附型病原体识别受体，能够结合宿主和微生物配体上的高甘露糖和岩藻糖基化聚糖。该蛋白具有短的胞质尾、跨膜区段、由串联重复序列组成的茎部或颈部区域（驱动寡聚化）以及C端碳水化合物识别结构域（CRD）。CRD能够结合病毒包膜糖蛋白和细胞ICAM3上的高甘露糖N-连接寡糖。DC-SIGNR的颈部结构域形成的多聚体结构对于其与聚集聚糖的高亲和力相互作用至关重要，并决定了其病原体结合效率。结构和聚糖芯片比较分析表明，DC-SIGNR 和与其密切相关的 DC-SIGN 都能够识别 HIV-1 和丝状病毒等包膜病毒上的高甘露糖寡糖，但 DC-SIGNR 的配体谱更窄，不结合血型抗原，而且与 DC-SIGN 不同，它不会在内体 pH 值下释放配体，也不会介导内吞作用和循环利用，这表明 DC-SIGNR 主要作为一种粘附受体发挥作用，在内皮表面捕获糖基化的病原体，而不会将其引导至经典的抗原加工途径。在病毒感染中，DC-SIGNR 作为一种附着因子，能够增强多种病毒糖蛋白介导的感染：实验感染系统表明，DC-SIGNR 的表达能够增强由马尔堡病毒糖蛋白和 SARS 冠状病毒刺突蛋白驱动的病毒入侵，这与 DC-SIGN 的作用类似；此外，鼠源同源物（如 SIGNR1）也能增强埃博拉病毒和马尔堡病毒的入侵，这支持了 SIGN 家族凝集素在丝状病毒和冠状病毒的附着和传播中发挥保守作用的观点。DC-SIGNR 的颈部结构域多态性能够调节这一功能；串联重复序列数量的差异会改变寡聚化状态，从而影响多价聚糖的结合；体外分析表明，较短的颈部变体能够降低 HIV 和埃博拉病毒的结合和反式增强作用，这表明 DC-SIGNR 的遗传变异与个体间易感性或病毒传播效率的差异有关。

使用信息

抗体应用 WB, IHC 稀释比例
WB IHC
1:1000 - 1:10000 1:500
反应性 Human
抗体类型 Rabbit Monoclonal Antibody MW 45 kDa
储存液配方 PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3
储存条件
(自收到货起)		 -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years
WB
实验步骤：
 
样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。
2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。
3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。
4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
 
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表
2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
 
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；
4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表
湿转法参考条件：200 mA, 120 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
 
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
 
抗体孵育
1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:10000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；
2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
 
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
 
IHC
实验步骤：
 
脱蜡/补液
1. 脱蜡/水合切片：
2. 将切片在二甲苯中孵育 3 次，每次 5 分钟。
3. 将切片在 100% 乙醇中孵育两次，每次 10 分钟。
4. 将切片在 95% 乙醇洗涤液中孵育两次，每次 10 分钟。
5. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
6.抗原修复：对于柠檬酸盐：将载玻片浸入 1X 柠檬酸盐暴露溶液中，在微波炉中加热，直至开始沸腾； 在亚沸温度 (95°-98°C) 下继续煮 10 分钟。 在工作台上冷却玻片 30 分钟。
 
染色
1. 用 dH2O 清洗切片 3 次，每次 5 分钟。
2. 将切片在 3% 过氧化氢中孵育 10 分钟。
3. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
4. 在洗涤缓冲液中洗涤切片 5 分钟。
5. 用 100–400 µl 封闭液在室温下封闭每个切片 1 小时。
6. 除去封闭液，并向每个切片中添加 100–400 µl 一抗稀释液。 4°C 孵育过夜。
7. 去除抗体溶液，用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
8. 用 1-3 滴所需的 HRPA 覆盖切片。 在加湿室中室温孵育 30 分钟。
9. 用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
10. 使用前将 DAB 显色剂浓缩液加入 DAB 稀释液中并充分混合。
11. 在每个切片上涂抹 100–400 µl DAB 并密切监测。 1-10 分钟通常可提供可接受的染色强度。
12. 将载玻片浸入 dH2O 中。
13. 如果需要，用苏木精复染切片。
14. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
15. 切片脱水：95%乙醇孵育切片两次，每次 10 秒； 在 100% 乙醇中重复，孵育切片两次，每次 10 秒； 在二甲苯中重复，孵育切片两次，每次 10 秒。
16. 用盖玻片和封固剂封固切片。
 

Application Data

WB

Validated by Selleck

  • Lane 1: THP-1