DDB1 Antibody [M17E15] Datasheet

生物描述

特异性	DDB1 Antibody [M17E15] 可检测内源性 DDB1 总蛋白水平。
背景	DDB1（损伤特异性DNA结合蛋白1）是CRL4泛素E3连接酶家族的支架亚基，它通过将多种底物受体募集到受损染色质位点，协调核苷酸切除修复的起始、组蛋白的移除以及细胞周期检查点的执行。其螺旋桨状结构具有一个中央β折叠核心，可容纳DDB2的WD40结构域，用于损伤特异性识别环丁烷嘧啶二聚体和6-4光产物；而侧面则可与CUL4A-ROC1对接，催化XPC、DDB2自身以及组蛋白H3/H4等修复因子的K48/K63连接的多聚泛素化。紫外线照射后，DDB1 以 DDB2 依赖的方式从可溶性组分转移到紧密结合于染色质的组分，促进泛素化介导的核心组蛋白置换，从而暴露损伤位点，以便 XPC 装载和 TFIIH 募集；这种组蛋白密码的交接允许双重切口，同时防止易错修复。DDB1 为其他 DCAF 提供支架，例如用于 HIV 整合的 VprBP 和用于复制许可的 CDT1，并通过 p21/p27 降解将 DNA 损伤与 G1/S 期转换整合。DDB1 维持增殖组织中的基因组稳定性，其急性耗竭会通过未解决的复制压力触发神经祖细胞和造血干细胞中 p53 依赖性凋亡。着色性干皮病 E 的致病突变是由于紫外线照射导致的 DDB1 组装缺陷，而 CUL4-DDB1 过表达则通过 CDT1 过度降解和复制起始激活驱动肿瘤发生。

特异性

DDB1 Antibody [M17E15] 可检测内源性 DDB1 总蛋白水平。

背景

DDB1（损伤特异性DNA结合蛋白1）是CRL4泛素E3连接酶家族的支架亚基，它通过将多种底物受体募集到受损染色质位点，协调核苷酸切除修复的起始、组蛋白的移除以及细胞周期检查点的执行。其螺旋桨状结构具有一个中央β折叠核心，可容纳DDB2的WD40结构域，用于损伤特异性识别环丁烷嘧啶二聚体和6-4光产物；而侧面则可与CUL4A-ROC1对接，催化XPC、DDB2自身以及组蛋白H3/H4等修复因子的K48/K63连接的多聚泛素化。紫外线照射后，DDB1 以 DDB2 依赖的方式从可溶性组分转移到紧密结合于染色质的组分，促进泛素化介导的核心组蛋白置换，从而暴露损伤位点，以便 XPC 装载和 TFIIH 募集；这种组蛋白密码的交接允许双重切口，同时防止易错修复。DDB1 为其他 DCAF 提供支架，例如用于 HIV 整合的 VprBP 和用于复制许可的 CDT1，并通过 p21/p27 降解将 DNA 损伤与 G1/S 期转换整合。DDB1 维持增殖组织中的基因组稳定性，其急性耗竭会通过未解决的复制压力触发神经祖细胞和造血干细胞中 p53 依赖性凋亡。着色性干皮病 E 的致病突变是由于紫外线照射导致的 DDB1 组装缺陷，而 CUL4-DDB1 过表达则通过 CDT1 过度降解和复制起始激活驱动肿瘤发生。

使用信息

抗体应用

WB

稀释比例

WB

1:1000

反应性

Human, Mouse, Rat, Monkey

抗体类型

Rabbit Monoclonal Antibody

MW

127 kDa

储存液配方

PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3

储存条件
(自收到货起)

-20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years

实验方法
WB	实验步骤：样品制备 1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液； 5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度； 6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。电泳分离 1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：5 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）转膜 1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中； 2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗； 3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表湿转法参考条件：200 mA, 120 min。（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）封闭 1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min； 2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温； 3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。抗体孵育 1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min； 3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h； 4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。显色 1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀； 2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

实验方法

WB

实验步骤：

样品制备

1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆。

2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。

3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。

4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；

5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；

6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。

电泳分离

1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：5 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表

2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）

转膜

1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；

2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；

3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；

4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表

湿转法参考条件：200 mA, 120 min。

（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）

封闭

1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；

2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；

3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

抗体孵育

1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；

2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；

3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；

4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

显色

1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；

2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

文献参考

Application Data

WB

Validated by Selleck

Lane 1: Hela, Lane 2: 3T3, Lane 3: PC-12, Lane 4: COS-7