EAAT3 Rabbit mAb

目录号：F1477

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生物描述

特异性

EAAT3 Rabbit mAb识别内源性EAAT3总蛋白水平。
背景

神经递质谷氨酸 (Glu) 是哺乳动物大脑中的主要兴奋性神经递质。其细胞外调节由兴奋性氨基酸转运体 (EAAT) 介导，由基因 SLC1A3、SLC1A2、SLC1A1、SLC1A6 和 SLC1A7 编码，分别对应于人类的 EAAT1、-2、-3、-4 和 -5。 EAAT 是次级主动转运体，通过转运三个钠离子、一个质子和反向转运每个底物中的一个钾离子，使谷氨酸逆电化学梯度移动。EAAT 可以转运谷氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸和丝氨酸-O-硫酸盐，EAAT3 也能有效转运半胱氨酸。EAAT3 在脑和各种外周组织中广泛表达。EAAT3 的敲低会导致神经元强直抑制作用降低，因为 GABA 能神经元对谷氨酸的吸收减少，从而影响 GABA 的合成。EAAT3 在谷氨酸能和 GABA 能神经传递以及氧化还原稳态中发挥作用。

使用信息

抗体应用 WB, IP, IF 稀释比例
WB IP IF
1:1000 1:100 1:800
反应性 Human, Mouse, Rat
抗体类型 Rabbit MW 70 kDa
储存液配方 PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3
储存条件
(自收到货起)		 –20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years
WB

Western Blotting

 
样品制备
1. 吸去培养基,用1X PBS清洗细胞。
2. 加入1X SDS上样缓冲液裂解细胞,将提取物转移至微量离心管中。置于冰上。
3. 超声10–15秒,完成细胞裂解和DNA剪切。
4. 将20 µl样品在95–100°C加热5分钟,然后置于冰上冷却。
5. 离心5分钟(使用微量离心机)。
6. 将适量样品上样至SDS-PAGE凝胶(上样量取决于提取蛋白浓度)。注意:同时请上样预染分子量标准,以确定分子量并验证电转效果。
7. 电转至硝酸纤维素膜/PVDF膜 (湿转法参考条件: 150mA 120min)。
 
膜封闭与抗体孵育
a. 封闭
1. (可选)转膜完成后,用TBS室温洗膜5分钟。
2. 将膜在封闭液中室温孵育1小时。
3. 用TBST洗涤3次,每次5分钟。
 
b. 抗体孵育
1. 将膜与一抗(按推荐的稀释度和稀释液配制)置于一抗稀释缓冲液中,4°C温和摇床过夜孵育。
2. 用TBST洗涤3次,每次5分钟。
3. 将膜与适当的二抗(稀释于封闭液中)在室温下温和摇床孵育1小时。
4. 用TBST洗涤3次,每次5分钟。
5. 进行检测。
 
显影检测
1. 抗体孵育结束后,用TBST洗膜3次,每次5分钟。
2. 配制ECL发光试剂(或根据二抗类型选择其他显色剂/底物)。混匀。
3. 将底物与膜孵育1分钟,去除多余溶液(膜保持湿润),置于显影仪中进行曝光。
IF

实验步骤：

 
标本制备
1. 吸出液体，然后用 1X PBS 稀释的 4% 多聚甲醛覆盖细胞至 2-3 mm 的深度。
注意：多聚甲醛有毒，只能在通风橱中使用。
2. 室温固定细胞 15 分钟。
3. 吸出固定液，用 1X PBS 冲洗 3 次，每次 5 分钟。
4. 继续进行免疫染色。
 
免疫染色
1. 添加封闭缓冲液并在室温下孵育 60 分钟。
2. 按照建议在抗体稀释缓冲液中制备一抗稀释液。
3. 吸出封闭液，加入制备好的一抗稀释液。
4. 4°C 孵育过夜。
5. 在 1X PBS 中冲洗 3 次，每次 5 分钟。
6. 将样本放入用抗体稀释缓冲液稀释的荧光染料偶联二抗中，室温避光孵育 1-2 小时。
7. 在 1X PBS 中冲洗 3 次，每次 5 分钟。
8. 使用带有 DAPI 的封固剂封固载玻片并盖上盖玻片。
9. 为获得最佳效果，请让封固剂在室温下固化过夜。 如需长期保存，请将载玻片平放在 4°C 避光保存。

Application Data

WB

Validated by Selleck

  • Lane 1: Mouse brain
    Lane 2: Mouse testis
    Lane 3: Rat brain
    Lane 4: Human cortex