Eps15 Rabbit mAb

目录号：F1282

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生物描述

特异性

Eps15 Rabbit mAb别内源性Eps15总蛋白。根据序列比对，该抗体可与Eps15a和Eps15b反应。该抗体不与Eps15R发生交叉反应。
背景

Eps15（EGFR 通路底物 15）最初被确定为 EGFR 激酶活性的底物。它具有三部分结构，包括具有三个 EH 结构域的 NH2 末端部分、中央假定的卷曲螺旋区域和具有多个天冬氨酸-脯氨酸-苯丙氨酸三联体的 COOH 末端结构域。 Eps15 位于网格蛋白小窝，与网格蛋白组装复合物 AP-2 和 AP-2 结合蛋白 Epsin 相互作用。破坏 Eps15 和 Epsin 的功能会抑制 EGF 和转​​铁蛋白的受体介导内吞作用，表明它们在内吞机制中发挥作用，包括突触囊泡膜内吞作用。如电子显微镜所示，Eps15 与 AP-2、Synaptojanin1 和 Epsin 结合，与质膜网格蛋白小窝和囊泡共定位，并位于出芽小窝的边缘。微注射抗 Eps15 抗体可抑制 EGF 和转​​铁蛋白的内化，而 Eps15 的 COOH 末端区域 (aa 529-897) 的过度表达通过阻止 Eps15 与 AP-2 复合物结合，充当内吞作用的显性负抑制剂。

使用信息

抗体应用 WB, IP, IF 稀释比例
WB IP IF
1:1000 1:100 1:200
反应性 Human, Mouse, Rat, Monkey
抗体类型 Rabbit MW 138 kDa
储存液配方 PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3
储存条件
(自收到货起)		 –20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years
WB
Western Blotting
 
样品制备
1. 吸去培养基,用1X PBS清洗细胞。
2. 加入1X SDS上样缓冲液裂解细胞,将提取物转移至微量离心管中。置于冰上。
3. 超声10–15秒,完成细胞裂解和DNA剪切。
4. 将20 µl样品在95–100°C加热5分钟,然后置于冰上冷却。
5. 离心5分钟(使用微量离心机)。
6. 将适量样品上样至SDS-PAGE凝胶(上样量取决于提取蛋白浓度)。注意:同时请上样预染分子量标准,以确定分子量并验证电转效果。
7. 电转至硝酸纤维素膜/PVDF膜 (湿转法参考条件: 200mA 150min)。
 
膜封闭与抗体孵育
a. 封闭
1. (可选)转膜完成后,用TBS室温洗膜5分钟。
2. 将膜在封闭液中室温孵育1小时。
3. 用TBST洗涤3次,每次5分钟。
 
b. 抗体孵育
1. 将膜与一抗(按推荐的稀释度和稀释液配制)置于一抗稀释缓冲液中,4°C温和摇床过夜孵育。
2. 用TBST洗涤3次,每次5分钟。
3. 将膜与适当的二抗(稀释于封闭液中)在室温下温和摇床孵育1小时。
4. 用TBST洗涤3次,每次5分钟。
5. 进行检测。
 
显影检测
1. 抗体孵育结束后,用TBST洗膜3次,每次5分钟。
2. 配制ECL发光试剂(或根据二抗类型选择其他显色剂/底物)。混匀。
3. 将底物与膜孵育1分钟,去除多余溶液(膜保持湿润),置于显影仪中进行曝光。
IF
实验步骤：
 
标本制备
1. 吸出液体，然后用 1X PBS 稀释的 4% 多聚甲醛覆盖细胞至 2-3 mm 的深度。
注意：多聚甲醛有毒，只能在通风橱中使用。
2. 室温固定细胞 15 分钟。
3. 吸出固定液，用 1X PBS 冲洗 3 次，每次 5 分钟。
4. 继续进行免疫染色。
 
免疫染色
1. 添加封闭缓冲液并在室温下孵育 60 分钟。
2. 按照建议在抗体稀释缓冲液中制备一抗稀释液。
3. 吸出封闭液，加入制备好的一抗稀释液。
4. 4°C 孵育过夜。
5. 在 1X PBS 中冲洗 3 次，每次 5 分钟。
6. 将样本放入用抗体稀释缓冲液稀释的荧光染料偶联二抗中，室温避光孵育 1-2 小时。
7. 在 1X PBS 中冲洗 3 次，每次 5 分钟。
8. 使用带有 DAPI 的封固剂封固载玻片并盖上盖玻片。
9. 为获得最佳效果，请让封固剂在室温下固化过夜。 如需长期保存，请将载玻片平放在 4°C 避光保存。
 

Application Data

WB

Validated by Selleck

  • Lane 1: Hela
    Lane 2: A431
    Lane 3: A172
    Lane 4: HCT-15
    Lane 5: NCI-H226
    Lane 6: T-470
    Lane 7: MCF7
    Lane 8: CCRF-CEM
    Lane 9: SR