GCLC Antibody [C5F2] Datasheet

生物描述

特异性	GCLC Antibody [C5F2] 用于检测内源性 GCLC 总的蛋白水平。
背景	谷氨酸-半胱氨酸连接酶催化亚基 (GCLC) 是参与谷胱甘肽 (GSH) 生物合成的关键酶，谷胱甘肽是一种必需的抗氧化因子，有助于保护细胞免受氧化损伤并维持细胞氧化还原平衡。GCLC 是异二聚酶复合物 GCL 的一部分，由 GCLC 和修饰亚基 GCLM 组成。该酶具有高度保守的活性位点，负责催化 GSH 合成的第一步和限速步骤，该步骤涉及谷氨酸和半胱氨酸连接形成 γ-谷氨酰半胱氨酸。其主要作用是催化 GSH 前体 γ-谷氨酰半胱氨酸的形成。该过程对于细胞防御氧化应激、解毒和维持细胞内氧化还原稳态至关重要。GCLC 与 GCLM 结合，调控 GSH 的产生率，使其成为维持正常细胞功能的关键酶。 GCLC 活性受其与 GCLM 相互作用的严格调控。GCLM 可增强 GCLC 的催化效率，并且酶的活性可根据氧化应激和代谢状态的变化进行调控。此外，在氧化应激期间，GCLC 表达会上调，以满足对 GSH 的增加的需求。它还参与解毒、免疫应答调控和对活性氧 (ROS) 的保护。GCLC 活性和 GSH 产生的失调与帕金森病等神经退行性疾病有关，氧化应激是其中的一个突出特征。

特异性

GCLC Antibody [C5F2] 用于检测内源性 GCLC 总的蛋白水平。

背景

谷氨酸-半胱氨酸连接酶催化亚基 (GCLC) 是参与谷胱甘肽 (GSH) 生物合成的关键酶，谷胱甘肽是一种必需的抗氧化因子，有助于保护细胞免受氧化损伤并维持细胞氧化还原平衡。GCLC 是异二聚酶复合物 GCL 的一部分，由 GCLC 和修饰亚基 GCLM 组成。该酶具有高度保守的活性位点，负责催化 GSH 合成的第一步和限速步骤，该步骤涉及谷氨酸和半胱氨酸连接形成 γ-谷氨酰半胱氨酸。其主要作用是催化 GSH 前体 γ-谷氨酰半胱氨酸的形成。该过程对于细胞防御氧化应激、解毒和维持细胞内氧化还原稳态至关重要。GCLC 与 GCLM 结合，调控 GSH 的产生率，使其成为维持正常细胞功能的关键酶。 GCLC 活性受其与 GCLM 相互作用的严格调控。GCLM 可增强 GCLC 的催化效率，并且酶的活性可根据氧化应激和代谢状态的变化进行调控。此外，在氧化应激期间，GCLC 表达会上调，以满足对 GSH 的增加的需求。它还参与解毒、免疫应答调控和对活性氧 (ROS) 的保护。GCLC 活性和 GSH 产生的失调与帕金森病等神经退行性疾病有关，氧化应激是其中的一个突出特征。

使用信息

抗体应用

WB, IP

稀释比例

WB	IP
1:20000	1:50

反应性

Human, Mouse, Rat

抗体类型

Rabbit Monoclonal Antibody

MW

73 kDa

储存液配方

PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN₃

储存条件
(自收到货起)

-20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years

实验方法
WB	实验步骤：样品制备 1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 将细胞转移至EP管中。用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声破碎，冰上静置裂解 30 min。冰上静置裂解 5 min。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液； 5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度； 6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。电泳分离 1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）转膜 1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中； 2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗； 3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表湿转法参考条件：200 mA, 120 min。（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）封闭 1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min； 2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温； 3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。抗体孵育 1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:20000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min； 3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h； 4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。显色 1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀； 2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。 (建议曝光时长 90s 以上)。

实验方法

WB

实验步骤：

样品制备

1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。

2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 将细胞转移至EP管中。用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声破碎，冰上静置裂解 30 min。冰上静置裂解 5 min。

3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。

4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；

5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；

6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。

电泳分离

1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表

2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）

转膜

1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；

2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；

3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；

4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表

湿转法参考条件：200 mA, 120 min。

（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）

封闭

1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；

2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；

3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

抗体孵育

1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:20000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；

2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；

3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；

4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

显色

1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；

2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。 (建议曝光时长 90s 以上)。

文献参考

[1] Chen Y, et al. J Biol Chem. 2005 Oct 7;280(40):33766-74.

Application Data

WB

Validated by Selleck

Lane 1: Jurkat
Lane 2: C6
Lane 3: NIH/3T3