GSDMD Rabbit mAb

目录号：F1568

打印

生物描述

特异性 GSDMD Rabbit mAb 用于检测内源性 GSDMD 总的蛋白水平。
背景 GSDMD（Gasdermin D）是驱动焦亡（pyroptosis）的关键效应蛋白，焦亡是一种炎症性程序性细胞死亡形式，且在宿主防御、自身免疫疾病和各种炎症性疾病中发挥重要作用。从结构上看，GSDMD由一个负责孔形成的N端结构域（GSDMD-NT）和一个在正常条件下维持自我抑制的C端结构域（GSDMD-CT）组成。在炎症信号的作用下，像半胱天冬酶-1、-4、-5和-11等半胱天冬酶会裂解GSDMD，释放出GSDMD-NT，该片段会发生寡聚并形成膜孔，进而介导焦亡及促炎细胞因子如IL-1β和IL-18的释放。GSDMD广泛表达于免疫细胞和上皮细胞，并通过转录后、翻译后及表观遗传修饰进行调控，包括泛素化、琥珀化和启动子甲基化。除了其裂解功能，GSDMD还在细胞因子释放中展现出非裂解作用，特别是在肠道等特定组织中。由于其在炎症和细胞死亡中的核心作用，GSDMD被认为是一个有前景的治疗靶点，已经开发了几种抑制剂，能够阻断其裂解或寡聚，具有治疗与焦亡相关疾病的潜力。

使用信息

抗体应用 WB, IP, IHC, IF, FCM 稀释比例
WB IP IHC IF FCM
1:1000-1:2000 1:30 1:1000 1:50 1:500
反应性 Mouse, Rat
抗体类型 Rabbit MW 53 kDa, 31 kDa
储存液配方 PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3
储存条件
(自收到货起)		 -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years
WB
实验步骤：
 
样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。
2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 将细胞转移至EP管中。用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声破碎，冰上静置裂解 30 min。冰上静置裂解 5 min。
3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。
4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
 
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表
2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
 
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；
4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表
湿转法参考条件：200 mA, 120 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
 
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
 
抗体孵育
1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；
2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
 
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
 

Application Data