HMGCS1 Antibody (Rabbit mAb) [D13C18]

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生物描述

特异性 HMGCS1 Antibody (Rabbit mAb) [D13C18] 可检测内源性 HMGCS1 总蛋白水平。
背景 3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合酶1 (HMGCS1) 是HMG-CoA合酶的胞质同工酶，作为胆固醇生物合成甲羟戊酸途径的第一个关键酶，催化乙酰辅酶A与乙酰乙酰辅酶A缩合生成HMG-CoA，后者直接进入HMG-CoA还原酶，进而参与下游甾醇和非甾醇类异戊二烯的合成。该酶属于硫解酶超家族，是一种同源二聚体胞质蛋白，其催化位点定位乙酰辅酶A和乙酰乙酰辅酶A进行克莱森缩合，从而形成一个控制乙酰基从中心碳代谢进入甲羟戊酸途径的通道。 HMGCS1活性将乙酰辅酶A的可用性与甲羟戊酸衍生的产物（如胆固醇、多萜醇、泛醌和异戊二烯供体）的合成联系起来，从而影响膜生物合成、蛋白质异戊二烯化以及其他支持细胞生长和存活的脂质依赖性过程。HMGCS1在许多组织中均可检测到表达，并且与胆固醇合成活跃的位点相吻合。其转录调控与甾醇调控网络整合，该网络协调HMGCS1与HMG-CoA还原酶和其他甲羟戊酸酶，以维持细胞内甾醇稳态。HMGCS1表达升高是甲羟戊酸途径活性增强的肿瘤细胞的常见特征，其中HMGCS1水平升高与侵袭性表型相关，并为管腔型和基底型乳腺癌模型中富含癌症干细胞的亚群提供代谢特征，并将该酶与自我更新能力和耐药相关性状联系起来。在这些乳腺癌模型中，功能性靶向HMGCS1比标准他汀类药物治疗更能显著降低癌症干细胞标志物、球体形成能力和致瘤特性，并且其作用于HMG-CoA还原酶上游的HMG-CoA生成水平。在胃癌中，HMGCS1的表达与肿瘤进展密切相关，通路分析表明该酶是一个调控节点，其活性通过持续提供致癌信号传导和膜动力学所需的甲羟戊酸中间体，从而支持细胞增殖、迁移和其他恶性特性。

使用信息

抗体应用 WB, IP, IHC 稀释比例
WB IP IHC
1:1000-1:200000 1:30 1:100
反应性 Human, Mouse, Rat
抗体类型 Rabbit Monoclonal Antibody MW 57 kDa
储存液配方 PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3
储存条件
(自收到货起)		 -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years
WB
实验步骤：
 
样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。
2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。
3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。
4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
 
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表
2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
 
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；
4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表
湿转法参考条件：200 mA, 120 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
 
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
 
抗体孵育
1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:200000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；
2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
 
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
 
IHC
实验步骤：
 
脱蜡/补液
1. 脱蜡/水合切片：
2. 将切片在二甲苯中孵育 3 次，每次 5 分钟。
3. 将切片在 100% 乙醇中孵育两次，每次 10 分钟。
4. 将切片在 95% 乙醇洗涤液中孵育两次，每次 10 分钟。
5. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
6.抗原修复：对于柠檬酸盐：将载玻片浸入 1X 柠檬酸盐暴露溶液中，在微波炉中加热，直至开始沸腾； 在亚沸温度 (95°-98°C) 下继续煮 10 分钟。 在工作台上冷却玻片 30 分钟。
 
染色
1. 用 dH2O 清洗切片 3 次，每次 5 分钟。
2. 将切片在 3% 过氧化氢中孵育 10 分钟。
3. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
4. 在洗涤缓冲液中洗涤切片 5 分钟。
5. 用 100–400 µl 封闭液在室温下封闭每个切片 1 小时。
6. 除去封闭液，并向每个切片中添加 100–400 µl 一抗稀释液。 4°C 孵育过夜。
7. 去除抗体溶液，用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
8. 用 1-3 滴所需的 HRPA 覆盖切片。 在加湿室中室温孵育 30 分钟。
9. 用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
10. 使用前将 DAB 显色剂浓缩液加入 DAB 稀释液中并充分混合。
11. 在每个切片上涂抹 100–400 µl DAB 并密切监测。 1-10 分钟通常可提供可接受的染色强度。
12. 将载玻片浸入 dH2O 中。
13. 如果需要，用苏木精复染切片。
14. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
15. 切片脱水：95%乙醇孵育切片两次，每次 10 秒； 在 100% 乙醇中重复，孵育切片两次，每次 10 秒； 在二甲苯中重复，孵育切片两次，每次 10 秒。
16. 用盖玻片和封固剂封固切片。
 

Application Data

WB

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  • Lane 1: DLD-1, Lane 2: LNCaP, Lane 3: PC-3, Lane 4: C2C12