HRS Rabbit mAb

目录号：F1442

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生物描述

特异性

HRS Rabbit mAb识别内源性HRS总蛋白水平。
背景

肝细胞生长因子调节酪氨酸激酶底物 (HRS) 是一种早期内体蛋白，可调节生长因子受体复合物的运输。它与 PELP1 结合，将其隔离在细胞质中并以 EGF 受体依赖性方式激活 MAPK，不依赖于雌激素受体、Shc 和 Src。HRS 是一种主要的酪氨酸磷酸化蛋白，广泛表达并被各种生长因子和细胞因子磷酸化。它包含一个 VHS 结构域、网格蛋白盒结构域、磷脂酰肌醇 3-磷酸相互作用 FYVE 结构域、两个卷曲螺旋结构域、一个脯氨酸结构域和一个富含脯氨酸/谷氨酰胺的结构域。HRS 定位于细胞质和膜相关区室，受磷脂酰肌醇 3-磷酸与 FYVE 结构域的相互作用调节。它与 STAM、Smad2、EPS15、SNAP25 和网格蛋白相互作用，充当囊泡运输和信号传导的整合子，并参与内体 EGFR 分选。

使用信息

抗体应用 WB, IP, IF 稀释比例
WB IP IF
1:1000 1:100 1:400
反应性 Human, Mouse, Monkey
抗体类型 Rabbit MW 100 kDa
储存液配方 PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3
储存条件
(自收到货起)		 –20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years
WB

Western Blotting

 
样品制备
1. 吸去培养基,用1X PBS清洗细胞。
2. 加入1X SDS上样缓冲液裂解细胞,将提取物转移至微量离心管中。置于冰上。
3. 超声10–15秒,完成细胞裂解和DNA剪切。
4. 将20 µl样品在95–100°C加热5分钟,然后置于冰上冷却。
5. 离心5分钟(使用微量离心机)。
6. 将适量样品上样至SDS-PAGE凝胶(上样量取决于提取蛋白浓度)。注意:同时请上样预染分子量标准,以确定分子量并验证电转效果。
7. 电转至硝酸纤维素膜/PVDF膜 (湿转法参考条件: 200mA 150min)。
 
膜封闭与抗体孵育
a. 封闭
1. (可选)转膜完成后,用TBS室温洗膜5分钟。
2. 将膜在封闭液中室温孵育1小时。
3. 用TBST洗涤3次,每次5分钟。
 
b. 抗体孵育
1. 将膜与一抗(按推荐的稀释度和稀释液配制)置于一抗稀释缓冲液中,4°C温和摇床过夜孵育。
2. 用TBST洗涤3次,每次5分钟。
3. 将膜与适当的二抗(稀释于封闭液中)在室温下温和摇床孵育1小时。
4. 用TBST洗涤3次,每次5分钟。
5. 进行检测。
 
显影检测
1. 抗体孵育结束后,用TBST洗膜3次,每次5分钟。
2. 配制ECL发光试剂(或根据二抗类型选择其他显色剂/底物)。混匀。
3. 将底物与膜孵育1分钟,去除多余溶液(膜保持湿润),置于显影仪中进行曝光。
IF

实验步骤：

 
标本制备
1. 吸出液体，然后用 1X PBS 稀释的 4% 多聚甲醛覆盖细胞至 2-3 mm 的深度。
注意：多聚甲醛有毒，只能在通风橱中使用。
2. 室温固定细胞 15 分钟。
3. 吸出固定液，用 1X PBS 冲洗 3 次，每次 5 分钟。
4. 继续进行免疫染色。
 
免疫染色
1. 添加封闭缓冲液并在室温下孵育 60 分钟。
2. 按照建议在抗体稀释缓冲液中制备一抗稀释液。
3. 吸出封闭液，加入制备好的一抗稀释液。
4. 4°C 孵育过夜。
5. 在 1X PBS 中冲洗 3 次，每次 5 分钟。
6. 将样本放入用抗体稀释缓冲液稀释的荧光染料偶联二抗中，室温避光孵育 1-2 小时。
7. 在 1X PBS 中冲洗 3 次，每次 5 分钟。
8. 使用带有 DAPI 的封固剂封固载玻片并盖上盖玻片。
9. 为获得最佳效果，请让封固剂在室温下固化过夜。 如需长期保存，请将载玻片平放在 4°C 避光保存。

Application Data

WB

Validated by Selleck

  • Lane 1: A-431
    Lane 2: 786-O
    Lane 3: MOLT-4
    Lane 4: CCRF-CEM
    Lane 5: RPMI 8226
    Lane 6: SK-OV-3
    Lane 7: Neuro-2a
    Lane 8: PC-3
    Lane 9: M-1
    Lane 10: Hepa1-6
    Lane 11: COS-7