HSP27 mAb Datasheet

生物描述

特异性	HSP27 mAb 检测内源性 HSP27 总的蛋白水平。
背景	热休克蛋白 27 (HSP27) 是小分子热休克蛋白 (sHSP) 家族的成员，其特征是分子量范围为 12 至 43 kDa。与其他 sHSP 一样，HSP27 含有保守的 α-晶体蛋白结构域，与脊椎动物眼晶状体中的 α-晶体蛋白同源。HSP27 在氧化应激期间通过降低活性氧 (ROS) 水平发挥抗氧化因子的作用，这通过增加细胞内谷胱甘肽水平和降低细胞内铁水平来实现。它还在化学应激条件下充当抗凋亡因子，调控线粒体依赖性和线粒体非依赖性凋亡途径。例如，HSP27 在 Fas-FasL 介导的细胞凋亡期间与 DAXX 结合，阻止 DAXX 与 Ask1 相互作用。此外，它还与 Bax 和细胞色素 c 结合，从而抑制线粒体依赖性细胞凋亡并抑制 caspase 依赖性细胞死亡。HSP27 通过调控肌动蛋白细胞骨架动力学，在压力下维持细胞完整性方面发挥重要作用。它促进肌动蛋白聚合，同时还充当肌动蛋白封端蛋白，在热休克和其他应激条件下稳定细胞骨架。HSP27 在细胞和组织中以基础形式表达，在激活 p38 MAPK 通路后，MAPKAP 激酶 2/3 在多个丝氨酸残基处发生磷酸化。磷酸化后，HSP27 从大的寡聚体重组为较小的结构，例如二聚体和四聚体，从而增强其与其他蛋白质相互作用的能力。这种磷酸化根据细胞条件进行动态调控，并影响 HSP27 在肌动蛋白聚合、细胞骨架重组和蛋白质-蛋白质相互作用中的作用。

特异性

HSP27 mAb 检测内源性 HSP27 总的蛋白水平。

背景

热休克蛋白 27 (HSP27) 是小分子热休克蛋白 (sHSP) 家族的成员，其特征是分子量范围为 12 至 43 kDa。与其他 sHSP 一样，HSP27 含有保守的 α-晶体蛋白结构域，与脊椎动物眼晶状体中的 α-晶体蛋白同源。HSP27 在氧化应激期间通过降低活性氧 (ROS) 水平发挥抗氧化因子的作用，这通过增加细胞内谷胱甘肽水平和降低细胞内铁水平来实现。它还在化学应激条件下充当抗凋亡因子，调控线粒体依赖性和线粒体非依赖性凋亡途径。例如，HSP27 在 Fas-FasL 介导的细胞凋亡期间与 DAXX 结合，阻止 DAXX 与 Ask1 相互作用。此外，它还与 Bax 和细胞色素 c 结合，从而抑制线粒体依赖性细胞凋亡并抑制 caspase 依赖性细胞死亡。HSP27 通过调控肌动蛋白细胞骨架动力学，在压力下维持细胞完整性方面发挥重要作用。它促进肌动蛋白聚合，同时还充当肌动蛋白封端蛋白，在热休克和其他应激条件下稳定细胞骨架。HSP27 在细胞和组织中以基础形式表达，在激活 p38 MAPK 通路后，MAPKAP 激酶 2/3 在多个丝氨酸残基处发生磷酸化。磷酸化后，HSP27 从大的寡聚体重组为较小的结构，例如二聚体和四聚体，从而增强其与其他蛋白质相互作用的能力。这种磷酸化根据细胞条件进行动态调控，并影响 HSP27 在肌动蛋白聚合、细胞骨架重组和蛋白质-蛋白质相互作用中的作用。

使用信息

抗体应用

WB, IHC, IF

稀释比例

WB	IHC	IF
1:1000	1:50	1:400 - 1:1600

反应性

Human, Moneky

抗体类型

Mouse

MW

27 Kda

储存液配方

PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN₃

储存条件
(自收到货起)

-20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years

实验方法
WB	实验步骤：样品制备 1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含PMSF），低温匀浆。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含PMSF），冰上静置裂解 5 min。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含PMSF），冰上静置裂解 5 min。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液； 5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度； 6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。电泳分离 1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）转膜 1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中； 2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗； 53.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜）。 PVDF 膜孔径规格选择参照表湿转法参考条件：200 mA, 60 min。（电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）封闭 1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min； 2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温； 3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。抗体孵育 1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min； 3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h； 4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。显色 1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀； 2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

实验方法

WB

实验步骤：

样品制备

1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含PMSF），低温匀浆。

2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含PMSF），冰上静置裂解 5 min。

3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含PMSF），冰上静置裂解 5 min。

4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；

5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；

6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。

电泳分离

1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表

2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）

转膜

1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；

2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；

53.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；

4.将蛋白电转移至 PVDF膜上（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜）。 PVDF 膜孔径规格选择参照表

湿转法参考条件：200 mA, 60 min。（电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）

封闭

1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；

2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；

3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

抗体孵育

1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；

2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；

3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；

4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

显色

1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；

2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

文献参考

[1] Vidyasagar A, et al. Fibrogenesis Tissue Repair. 2012 May 7;5(1):7.

Application Data

WB

Validated by Selleck

Lane 1: HeLa
Lane 2: HeLa (KO HSP27)
Lane 3: COS-7