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生物描述

特异性

JNK1 (pY185) + JNK2 (pY185) +  JNK3 (pY223) mAb可识别内源性JNK1 (pY185) + JNK2 (pY185) + JNK3 (pY223)。该抗体不识别未发生磷酸化的JNK1/2/3。
背景

应激激活蛋白激酶/Jun-氨基末端激酶 (SAPK/JNK) 主要由多种环境胁迫信号触发，偶尔由生长因子（GF）和G蛋白偶联受体( GPCR) 激动剂触发。与其他 MAPK成员类似，其核心信号模块由 MAPKKK（通常是 MEKK1-MEKK4）或混合谱系激酶 (MLK) 之一组成，它们通过磷酸化激活 MKK4/7。激活后，MKK 进一步磷酸化并激活 SAPK/JNK 激酶。应激信号通过 Rho 家族的小 GTPase（Rac、Rho、cdc42）传递到此级联，其中 Rac1 和 cdc42 促进 MEKK 和 MLK 的刺激。另外，MKK4/7 的激活也可通过刺激生发中心激酶 (GCK) 家族成员独立于 GTPase 发生。SAPK/JNK 基因经历可变剪接，产生多种同工型。当 SAPK/JNK 作为二聚体活跃时，它可以转位到细胞核中，并通过影响 c-Jun、ATF-2 和各种其他转录因子来调节转录。

使用信息

抗体应用 WB, IP 稀释比例
WB IP
1:1000 1:70
反应性 Human, Mouse, Rat
抗体类型 Rabbit MW 48 kDa
储存液配方 PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3
储存条件
(自收到货起)		 –20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years
WB

Western Blotting

 
样品制备
1. 吸去培养基,用1X PBS清洗细胞。
2. 加入1X SDS上样缓冲液裂解细胞,将提取物转移至微量离心管中。置于冰上。
3. 超声10–15秒,完成细胞裂解和DNA剪切。
4. 将20 µl样品在95–100°C加热5分钟,然后置于冰上冷却。
5. 离心5分钟(使用微量离心机)。
6. 将适量样品上样至SDS-PAGE凝胶(上样量取决于提取蛋白浓度)。注意:同时请上样预染分子量标准,以确定分子量并验证电转效果。
7. 电转至硝酸纤维素膜/PVDF膜 (湿转法参考条件: 150mA 120min)。
 
膜封闭与抗体孵育
a. 封闭
1. (可选)转膜完成后,用TBS室温洗膜5分钟。
2. 将膜在封闭液中室温孵育1小时。
3. 用TBST洗涤3次,每次5分钟。
 
b. 抗体孵育
1. 将膜与一抗(按推荐的稀释度和稀释液配制)置于一抗稀释缓冲液中,4°C温和摇床过夜孵育。
2. 用TBST洗涤3次,每次5分钟。
3. 将膜与适当的二抗(稀释于封闭液中)在室温下温和摇床孵育1小时。
4. 用TBST洗涤3次,每次5分钟。
5. 进行检测。
 
显影检测
1. 抗体孵育结束后,用TBST洗膜3次,每次5分钟。
2. 配制ECL发光试剂(或根据二抗类型选择其他显色剂/底物)。混匀。
3. 将底物与膜孵育1分钟,去除多余溶液(膜保持湿润),置于显影仪中进行曝光。

Application Data

WB

Validated by Selleck

  • Lane 1: Hela
    Lane 2: 293
    Lane 3: COS-7
    Lane 4: NIH/3T3
    Lane 5: C6