目录号：F0145

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生物描述

特异性

LC3B Rabbit mAb 可检测内源性 LC3B 总的蛋白水平。
背景

自噬(Autophagy)是一个高度保守的过程，其中蛋白质和细胞器经历降解。 这些受损的成分随后被去除并通过溶酶体回收。 在多种自噬相关基因（Atgs）的调控下，自噬最终导致自噬体的形成。 LC3（微管相关蛋白 1 轻链 3）是该过程中的重要蛋白，可作为自噬标记物。 最初被鉴定为微管相关蛋白 1B (MAP1LC3) 的一个亚基，被命名为 LC3B。 在自噬过程中，三种人类 LC3 亚型（LC3A、LC3B 和 LC3C）会发生翻译后修饰。 LC3 最初合成，然后在羧基末端裂解，产生胞质 LC3-I 形式。 当自噬体形成时，可溶性 LC3B-I 通过涉及 Atg7 和 Atg3 的泛素样系统促进的脂化转化为自噬囊泡相关形式 (LC3B-II)。 这种修饰使 LC3 能够与自噬囊泡结合，使其成为自噬的可靠指标。

使用信息

抗体应用 WB, IF, F 稀释比例
WB IF FCM
1: 1000 1:1600 - 1:3200 1:200
反应性 Human
抗体类型 Rabbit MW 14 kDa, 16 kDa
储存液配方 PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3
储存条件
(自收到货起)		 –20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years
WB
实验步骤：
 
电泳分离
1.根据提取蛋白的浓度,加载适量蛋白样本和marker至SDS-PAGE胶上进行电泳；
2.电源调80V，30分钟。然后电源调（110V~150V），观察Marker，待蛋白所在的预染蛋白Marker指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流不要太大，电流太大（超过150mA）会导致温度上升，影响跑胶结果。如无法避免大电流，可以对电泳槽冰浴来降温。）
 
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化PVDF膜1分钟，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；
4.电源200mA，100分钟。将蛋白电转移至PVDF膜上。（注意电转条件可以按照蛋白大小适当调节，电流大可以节省时间同时对分子量大的蛋白效果好，但需要保持电转槽在低温的环境中，避免胶的融化。推荐不要超过250mA，120分钟。）
 
封闭(可选)
1.电转移后,室温下用TBS洗膜5分钟；
2.在封闭液中孵育膜1小时,室温；
3.用TBST洗膜3次,每次5分钟。
 
 抗体孵育
1.用5%的脱脂奶粉来配制一抗工作液（一抗稀释比1: 1000）,4°C条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；
2.用TBST洗膜3次,每次5分钟；
3.在封闭液中加入二抗,室温条件下与膜轻柔摇晃孵育1小时；
4.孵育结束后,用TBST洗膜3次,每次5分钟。
显色
1.加入配制好的ECL发光底物(或根据二抗选择其他显色基质)混合均匀；
2.与膜孵育1分钟,去除多余底物(保持膜湿润)，置于显影仪中进行曝光。
 
IF
实验步骤：
 
标本制备
1. 吸出液体，然后用 1X PBS 稀释的 4% 多聚甲醛覆盖细胞至 2-3 mm 的深度。
注意：多聚甲醛有毒，只能在通风橱中使用。
2. 室温固定细胞 15 分钟。
3. 吸出固定液，用 1X PBS 冲洗 3 次，每次 5 分钟。
4. 继续进行免疫染色。
 
免疫染色
1. 添加封闭缓冲液并在室温下孵育 60 分钟。
2. 按照建议在抗体稀释缓冲液中制备一抗稀释液。
3. 吸出封闭液，加入制备好的一抗稀释液。
4. 4°C 孵育过夜。
5. 在 1X PBS 中冲洗 3 次，每次 5 分钟。
6. 将样本放入用抗体稀释缓冲液稀释的荧光染料偶联二抗中，室温避光孵育 1-2 小时。
7. 在 1X PBS 中冲洗 3 次，每次 5 分钟。
8. 使用带有 DAPI 的封固剂封固载玻片并盖上盖玻片。
9. 为获得最佳效果，请让封固剂在室温下固化过夜。 如需长期保存，请将载玻片平放在 4°C 避光保存。
 

Application Data

WB

Validated by Selleck

  • Lane 1: HCT 116
    Lane 2: HCT 116 (KO LC3B)
    Lane 3: Hela
    Lane 4: Hela (KD LC3B)