Otoferlin Antibody [J18F12]

目录号：F2110

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生物描述

特异性 Otoferlin Antibody [J18F12] 可检测内源性 Otoferlin 总蛋白水平。
背景 耳蜗蛋白（Otoferlin）由OTOF基因编码，是ferlin家族中一种大型的多C2结构域蛋白，主要在耳蜗内毛细胞（IHCs）中表达。它作为突触带状突触中突触小泡胞吐的关键钙离子传感器，实现快速的声音编码和神经传递。耳蜗蛋白包含六个胞质C2结构域（C2A-F）；其中，C2B-F结构域通过富含天冬氨酸的环结合Ca²⁺，并与磷脂酰丝氨酸和PIP₂等磷脂以及SNARE蛋白（如syntaxin-1和SNAP-25）相互作用。它还包含一个FerA结构域（四螺旋束），可提供额外的Ca²⁺依赖性脂质结合能力；以及一个C端跨膜结构域（TMD），该结构域通过选择性剪接（耳蜗中为TMD1，脑中为TMD2）将耳蜗蛋白锚定到囊泡膜或质膜上。通过这些特性，耳蜗蛋白与L型Ca²⁺通道协同作用，促进Ca²⁺触发的谷氨酸囊泡融合，支持囊泡补充和内吞作用，并在各种强度下维持高保真度的听觉信号传导，这使其区别于慢速突触中的突触结合蛋白。 OTOF 中的突变，例如 C2B 中的 I318N 或 C2C 中的 p.Ile515Thr，会损害耳石蛋白的功能，导致 DFNB9 非综合征性隐性耳聋或温度敏感性听觉神经病谱系障碍 (ANSD)，但耳声发射功能保留。

使用信息

抗体应用 IF, FCM 稀释比例
FCM
1:1000
反应性 Mouse, Human
抗体类型 Mouse Monoclonal Antibody MW
储存液配方 PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3
储存条件
(自收到货起)		 -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years
IF
实验步骤：
样品准备
1. 贴壁细胞：取洁净无菌盖玻片置于培养皿中，待细胞接近长成单层后取出盖玻片。
2. 悬浮细胞：将细胞接种至多聚赖氨酸包被的洁净无菌载玻片上。
3. 冰冻切片：将玻片置于室温下解冻，纯水或 PBS 摇洗 3次，每次 3 min。
4. 石蜡切片：先将玻片脱蜡至水，纯水或 PBS 摇洗 3次，每次 3 min。然后进行抗原修复。
 
固定
1. 使用固定液，如4%多聚甲醛（4% PFA）室温固定细胞爬片/涂片或组织切片 10~15 min。
2. 使用 PBS 摇洗样品 3次，每次 3 min。
 
通透
1. 对样品添加去垢剂，如 0.1~0.3% Triton X-100，室温通透 10~20 min。
（仅针对胞内抗原，若是细胞膜上表达的抗原则可省略该步骤。）
2. 使用 PBS 摇洗样品 3次，每次 3 min。
 
封闭
添加封闭液，在室温下封闭至少 1 h。（常用的封闭液包括：与二抗同一来源的血清、BSA或山羊血清。）
注意事项：从封闭开始之后的所有步骤务必保证样品湿润，避免干燥，否则极易产生高背景。
 
免疫荧光染色（第一天）
1. 吸走封闭液，滴加稀释后的一抗。
2. 湿盒中 4°C 孵育过夜。
 
免疫荧光染色（第二天）
1. 吸走一抗，PBST 摇洗 3 次，每次 5 min。
2. 滴加稀释后的荧光二抗，避光 4°C 孵育 1~2 h。
3. 吸走二抗，PBST 摇洗 3 次，每次 5 min。
4. 滴加稀释后的 DAPI，室温避光 孵育 5~10 min。
5. PBST 中摇洗 3 次，每次 5 分钟。
 
封片
1. 抗荧光淬灭封片剂封片。
2. 干燥玻片，将玻片置于室温下避光过夜。
3. 将载玻片放入玻片盒中 4°C 避光保存。
 

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